脂质体/DNA复合物介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和生物活性

目的：探讨脂质体／ＨＳＶ—ＴＫ重组 ＤＮＡ对膀胱癌细胞的转导和在细胞内的活性表达。方法：用脂质体／ＤＮＡ复合物将 ＨＳＶ－ＴＫ基因逆转录病毒重组子（ｐＬＸＳＮ－ＴＫ）导入膀胱癌细胞株 ＢＩＵ８７。携带 ＨＳＶ一ＴＫ基因的 ＢＩＵ８７细胞（ＢＩＵ８７—ＴＫ）由 Ｇ４１８筛选获得。经过 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和细胞原位杂交检测后，观测 ＡＣＶ对 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞存活的影响。结果： Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实 ＨＳＶ—ＴＫ基因存在于 ＢＩＵ８７－ＴＫ细胞染色体中。细胞原位杂交检测 ＨＳＶ－ＴＫｍＲＮＡ的表达。外源ＤＮＡ的导入以及ＨＳＶ－ＴＫ和Ｎｅｏ基因表达不会改变细胞生长特性。然而，在ＡＣＶ作用下，转导ＨＳＶ－ＴＫ基因的膀胱癌细胞的存活率受到影响，ＡＣＶ可显著抑制癌细胞生长。结论：脂质体／ＴＫ重组 ＤＮＡ复合物可用于膀胱癌细胞的转基因治疗。

阳性脂质体介导基因转染及其研究进展

基因治疗是一种很有前景的治疗模式,而阳性脂质体介导的基因转染是目前基因治疗的研究热点之一。现综述近5年来有关阳性脂质体的文献,介绍了阳性脂质体的基本组成,并从生物学、理化性质及制剂学等几个方面介绍了影响阳性脂质体/DNA复合物转染效率的主要因素,最后从新的阳性脂质成分及阳性脂质体或阳性脂质体/DNA复合物的表面修饰等方面介绍了近年来有关改善阳性脂质体介导基因转染的研究进展。

阳性脂质体介导的转染法的研究

阳性脂质体介导的转染法是一种新的高效转染技术,以转染效率高,对外源核酸的大小无限制并可在体内和体外进行转染等优点已逐渐成为转染外源核酸进入真核细胞的重要方法。作者结合自己的试验结果及分析就阳性脂质体的组成、脂质体-DNA复合物(L ipop lex)的形成原理、基因转染的机制及影响转染效率的因素等作一综述。

脂质体——基因载体

概述了基因载体的作用、类型和脂质体用于基因载体的发展历史,介绍了一类很有前途的基因载体-阳离子脂质体的组成结构和分类及其转基因的作用原理,讨论了影响阳离子脂质体/DNA复合物物理化学性质的参数及其目标复合物的制备方法.

新型锍类化合物的合成及其DNA复合性能

报道了一类新型的以锍离子提供正电荷的阳离子脂质体的合成。以四氢噻吩和四氢噻喃为原料,在四氟硼酸银体系中与链状碘代脂肪烷烃经取代反应制得硫正离子化合物,产物用氯离子交换树脂交换得阴离子为氯离子的8种新型的链状锍类鎓氯盐脂质体化合物,其结构经~1H NMR,^(13)C NMR,FT-IR和HR-MS(ESI)表征。凝胶电泳阻滞实验表明该类锍化合物具有和DNA聚合并形成复合物的能力,随着脂肪链的增长,复合能力增强。

脂质体-γ-干扰素DNA复合物肝内直接注射对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨脂质体 γ干扰素(γIFN )DNA复合物肝纤维化肝脏内直接注射后的表达及对肝纤维化的影响。方法 用阳离子脂质体包裹人γIFNDNA ,并直接注射入肝纤维化大鼠的肝实质内,3周后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血内γIFN水平并评估肝纤维化程度变化。结果 肝内注射脂质体 γIFNDNA复合物的大鼠下腔静脉血中检测到了γIFN的表达(6.6±1.7)mg/L ,而对照组却未检出;行γIFN基因肝内注射的大鼠在基因转导前后,肝纤维化分期、Ⅳ型胶原染色及肝纤维化的Chevallier评分无明显改变(P >0 .0 5 ) ,且均显著轻于对照组(P <0 .0 5 )。结论 脂质体 DNA复合物进行肝实质内注射是一条肝纤维化肝内直接基因转导的有效途径。

DC-Chol脂质体DNA复合物体外对HBV的抑制作用

目的观察DC-Chol脂质体DNA复合物(DLDC)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法制备DLDC,HepG2.2.15细胞经不同浓度的DLDC作用后,检测其对细胞的毒性作用;提取细胞质DNA,用化学发光Southern blot法检测DLDC对细胞内HBV DNA复制的抑制作用。结果DLDC可抑制HepG2.2.15细胞增殖,其TC0为78.13 ng/ml,TC50为421.86 ng/ml;DLDC可抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制,其IC50为45 ng/ml,SI为9.37。结论DLDC对胞内HBV DNA的复制有明显的抑制作用。

阳离子脂质体介导基因转染肿瘤细胞

使用基因转运载体运载肿瘤细胞进行转染是基因治疗的关键环节之一。Lipofectamine 2000和DOTAP作为商品转染试剂,具有较高的转染效率。为了进一步发掘其作为基因转运载体的应用潜力,该文研究了Lipofectamine 2000和DOTAP的粒径、Zeta电位及形态,并分别与绿色荧光蛋白基因(pGFP-N2)、荧光素酶基因(pGL3)结合,形成脂质体/DNA复合物,通过载入人喉癌细胞(Hep-2)和人肺癌细胞(NCI-H460),考察了其转染效率和细胞毒性。结果表明,脂质体Lipofectamine 2000与DOTAP都能有效压缩DNA,形成复合物。Lipofectamine 2000与DOTAP相比,转染效率高,与DNA最佳转染比例范围为2:1～4:1。毒性实验显示,在N/P大于3/1时,Lipofectamine2000与DOTAP对癌细胞具有一定的细胞毒性。细胞种类对脂质体的转染效率有很大影响,Lipofectamine 2000对Hep-2细胞的转染效率比NCI-H460高。

磁性纳米靶向Apo-A-I基因治疗对大鼠动脉粥样硬化斑块发展的作用

目的观察载脂蛋白A族Ⅰ型(Apo-A-Ⅰ)基因对动脉粥样硬化(AS)斑块发展的作用。方法将超微超顺磁性氧化铁(USPIO)作为磁性纳米载药系统输送治疗基因,用逆相蒸发法制备带正电荷的磁性脂质体,再将DNA与该脂质体按照1∶7的电荷比形成复合物;将已形成AS斑块的12只大鼠分为实验组和对照组,实验组6只大鼠经尾静脉注入磁性纳米脂质体/DNA复合物,对照组6只大鼠经尾静脉注入不含基因的磁性纳米脂质体复合物,每只动物给药剂量为0.32 ml,给药后立刻在所有动物左侧肾脏附近(体外)绑缚铷铁硼稀土磁铁(场强500mT)进行磁诱导,约4h后将磁铁取下。继续喂养6周后抽血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL),并将动物处死,取腹主动脉进行油红O染色。结果基因治疗6周后,实验组80层切片中发现斑块10层,脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为9.21%和1.18%;对照组83层切片中发现斑块35层,脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为32.25%和1.66%。实验组与对照组进行斑块率的比较,P<0.01,实验组HDL水平明显升高,实验组肝组织Apo-A-ⅠmRNA水平明显高于对照组。结论DNA与逆相蒸发法制备的磁性脂质体形成的磁性纳米脂质体/DNA复合物在外加磁场导入下可以使Apo-A-Ⅰ基因定向到达肝脏,显著升高血浆HDL水平,降低LDL、TC、TG水平,抑制AS斑块的发展。

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染肺腺癌细胞系的研究

目的 获得稳定表达人呼吸道合胞病毒(h RSV) M2 - 1基因的人肺腺癌细胞系。方法 通过基因重组法构建h RSV M2 - 1基因真核表达载体,用脂质体将其转染人肺腺癌PAa和A5 4 9细胞,经G4 18筛选获得阳性表达细胞株,并用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)和Western Blot进行验证。结果 得到了约6 5 0 bp的基因插入片段,DNA测序表明该基因高度保守。筛选出了稳定高量表达M2 - 1基因的PAa和A5 4 9细胞,并被证实有M2 - 1蛋白表达。结论 获得了稳定表达h RSV M2 - 1蛋白的PAa和A5 4

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

目的探讨提高PC12细胞转染效率的方法。方法细胞培养板用10μg/mLⅠ型牛胶原蛋白包被,通过在转染过程中加入9μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8μmol/L聚胺类试剂亚精胺,同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间。考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响,转染时间对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较。结果①对PC12细胞转染,DNA∶Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4。②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时,PC12细胞转染率分别为35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%,4 h达到最大转染效率。③氯喹、亚精胺加入浓度的增加,PC12细胞转染效率随之增加,当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9μmol/L和8μmol/L时,PC12细胞的转染效率最高,转染效率为40.5%。④加入终浓度为9μmol/L氯喹与8μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度(590 nm)分别为(0.466±0.042)与(0.451±0.038),差异无统计学意义(P>0.05),对PC12细胞的活性无影响。⑤加入氯喹、亚精胺前、后,PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义(P>0.05)。⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5%、8.6%、11.8%及15.3%,本法PC12细胞转染率为40.5%,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论加入氯喹及亚精胺,实现阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞的高效转染,为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。

慢性乙肝活动期HBV复制与红细胞免疫功能变化的关系

目的分析慢性乙肝活动期HBV阳性与阴性患者体内红细胞(RBC)免疫粘附功能的变化。方法收集慢性乙肝活动期患者75例、正常体检者61例,应用萤光定量PCR法(FQ-PCR)检测血清方法HBV-DNA、酵母多糖粘附RBC免疫粘附功能。结果慢性乙肝活动期患者组RBCC3b受体花环率(RCR)明显低于正常对照组(P=0.021),而RBC免疫复合物花环率(RICR)显著高于正常对照组(P=0.033)。HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组相比较,HBV-DNA(+)组RCR降低(P=0.001),差异有显著性,RICR显著升高(P=0.013)。HBV-DNA(-)组与正常对照组比较,RICR增高(P=0.004)。RICR与RCR呈负相关(r=-0.460,P=0.000)。结论慢性乙肝活动期患者RBC免疫粘附功能低下。血清HBV-DNA复制与否与慢性乙肝活动期患者RBC免疫功能密切相关。

乙肝“两对半”详解

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，外形是直径为42nm的球形颗粒，由外膜和内膜组成。外膜主要有乙肝表面抗原(HBsAg)组成，HBsAg有多个抗原决定簇，血清学上分为多个不同的亚型，常见的为adr、adw和ayw。机体内HBsAg如为阳性，则表示体内感染HBV，因此，HBsAg是诊断乙型肝炎的特异性指标。如采用夹心法检测人血清(血浆)中的HBsAg，即用抗-HBs单克隆抗体包被固相板，加入待测样本和酶标记抗一HBs，当样本存在HBsAg时，可形成夹心复合物，经过洗涤后的板条，加入底物液A(含H2O2)、底物液B(含TMB)在酶的催化作用下产生显色反应，根据颜色深浅，判断HBsAg的阳性程度。