富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽体内外mRNA基因递送能力及安全性评价

mRNA基因治疗因其可扩展、修饰,不需要进入细胞核及不整合宿主遗传基因等优势而备受关注。在基因治疗中,将mRNA安全有效地递送到细胞内对于基因治疗的成功至关重要。本研究基于前期设计合成的富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(dendritic arginine&disulfide bond-containing cationic lipopeptide,RLS)基因载体在斑马鱼体内成功实现比商品化试剂Lipofectamine 2000高1.5倍的mRNA转染效果,并通过体外细胞毒性和斑马鱼体内生物安全性研究证实其具有良好的生物安全性。首先,通过核磁共振氢谱(1H NMR)及飞行时间质谱(MALDI-TOF)对阳离子脂质肽的化学成分进行表征。通过动态光散射粒度分析仪(DLS)测试的粒径和电位结果显示,在氮磷(N/P)比为20时,RLS与mRNA复合组装体形成平均粒径约220 nm、表面ζ电位约+21 mV的均匀纳米粒子。体外基因转染中,RLS在人胚肾293细胞(HEK293)和大鼠间充质干细胞(MSC)中的转染效率较Lipofectamine 2000分别提高1.2和3倍。此外,将RLS显微注射至斑马鱼胚胎后,通过评价生存率、孵化率和致畸率等指标,进一步证实了其在体内良好的安全性。综上所述,该富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽RLS具有优良的mRNA递送性能和安全性。

阳离子脂质肽用于单纯型大疱性表皮松解症基因治疗的初步评价

目的合成两亲性阳离子脂质肽(RLS),通过报告绿色荧光蛋白基因(pEGFP)及治疗基因野生型角蛋白14(KRT14)的表达水平检测,考察其在小鼠成纤维细胞L929、小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3和人永生化角质形成细胞HACAT中的基因递送效率。方法利用1HNMR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征RLS的化学结构。采用溶剂注入法制备RLS自组装体,检测其与基因复合前后的粒径、电位。将RLS自组装体与pEGFP静电吸附形成的基因复合物转染至L929、NIH-3T3、HACAT,利用EGFP表达平均荧光强度(MFI)半定量法评估复合物的转染效率,并在转染48 h后,采用CCK-8试剂法考察复合物对以上3种细胞的毒性。实时荧光定量PCR(q-PCR)检测KRT14 mRNA的表达水平。结果成功制备了粒径为142.8±0.9 nm,Zeta电位为28.7±0.4 mV的RLS自组装体。将其与DNA复合后,粒径增至167.1±2.3 nm,Zeta电位降至20.2±0.5 mV。RLS基因复合物在3种细胞中均未显示明显毒性。在转染L929、NIH-3T3和HACAT细胞后,RLS组的pEGFP的平均荧光强度分别为96、46、33。q-PCR结果显示:在L929、NIH-3T3、HACAT细胞中,RLS组KRT 14 mRNA的表达水平分别约是Lipo2000的130、100和5倍,是PEI的1.7×10^(5)、120、5倍,证明了阳离子脂质肽具有高的基因递送效率。结论RLS作为一种高效、安全的基因递送载体。在由KRT14基因突变引起的单纯型大疱性表皮松解症遗传性皮肤疾病中,具有一定的应用潜力。