经修饰的聚阳离子载体在基因治疗中的应用进展

合成的多聚物载体作为癌细胞靶向治疗的载体在基因治疗中发展迅猛,拥有广阔的研究前景。随着人类基因组测序工作的完成,基因靶序列的不断更新,基因病的存在促使人们发明一种以基因为基础的治疗方案。以往所采取的非病毒载体治疗手段存在着转染效率低、表达含量低等缺陷。在众多合成的多聚物载体中,聚烯酰亚胺、聚酰胺-胺型树状高分子材料在基因治疗中应用广泛。本文综述了以聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺型树状高分子材料作为基本结构进行修饰的基因载体的研究进展,并讨论了该领域未来可能的发展方向。

纳米阳离子多聚物在基因载体系统的应用

阳离子多聚物能与DNA通过静电吸附作用而自组装成纳米微粒,防止DNA被核酸酶降解。阳离子多聚物由于具备合成简便、储存稳定、基因荷载率高、靶向性强、免疫原性低等优点而被用作基因载体。阳离子多聚物按特性可分为两类:合成型和天然型。经典的人工合成型阳离子多聚物基因载体主要有:多聚乙烯亚胺、多聚左旋赖氨酸和树状大分子等;天然生物型阳离子多聚物基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等。本文详细论述了各种阳离子聚合物用作基因载体的性能特点、自身缺陷、介导基因进入细胞的机理和靶向性策略,并对非病毒基因载体的发展作出展望。

白蛋白包覆阳离子脂质纳米载体的制备及静脉注射药代动力学和组织分布

溶剂蒸发法制备普通阳离子脂质纳米载体(cNLCs)及白蛋白包覆的脂质纳米载体(BSA-cNLCs),cNLCs和BSA-cNLCs的粒径分别为69.9 nm和80 nm,电位分别为+12.5 mV和+5.02 mV。两者透射电镜照片均呈现圆整类球形结构,且BSA-cNlCs可见明显的白蛋白包覆层。紫杉醇包封率均在97%以上,载药量大于3.7%。加入血浆24 h后,cNLCs粒径增加至原来的1.7倍,而BSA-cNLCs仅增加至1.1倍,包覆白蛋白后血浆稳定性显著提高。高效液相色谱法研究大鼠体内药代动力学及荷瘤小鼠体内组织分布行为,静脉注射BSA-cNLCs 12 h后,大鼠血液中紫杉醇浓度为0.64μg/mL,而cNLCs组则无法检测到紫杉醇;BSA-cNLCs和cNLCs在荷瘤小鼠肿瘤组织中最高浓度分别为8.36μg/mL和2.52μg/mL,12 h后分别降至1.56μg/mL和0.57μg/mL。与cNLCs相比,BSA-cNLCs在血液中的滞留时间显著延长,表现出更好的长循环效果,靶向肿瘤组织的能力增加。

阳离子聚合物载体在体内基因治疗中的应用

基因治疗是一种对各种与基因相关、威胁到人类生命的疾病有重要潜在治疗作用的一种新的治疗方法[1].基因治疗在四十多年的发展道路上取得了很多惊人的成就,也遇到了很多困难.目前基因治疗要真正进入临床应用,还有一些根本问题没有解决,其中最重要的是安全、高效及可控的基因载体的构建[2].

阳离子聚合物作为基因载体的研究进展

随着对生物材料学、基因组学及药物学等研究的深入,阳离子聚合物材料在基因传递、药物释放的研究中发挥着越来越重要的作用,受到研究者广泛的关注和重视。文中就阳离子聚合物作为基因载体的特点、研究进展和趋势等作一概述。

阳离子型纳米载体在递送抗肿瘤药物过程中的细胞转运机制及影响因素的研究概况

目的:综述阳离子型纳米载体在递送抗肿瘤药物过程中的细胞转运机制及影响因素,为阳离子型纳米载体介导的肿瘤靶向给药系统的设计提供参考。方法:以“阳离子载体”“细胞摄取”“胞内转运”“细胞外排”“Cationic carrier”“Cell uptake”“Intracellulartransportation”“Exocytosis”等为关键词,组合查询2000年1月-2018年9月收录在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、Elsevier等数据库中的相关文献,对阳离子型纳米载体在递送抗肿瘤药物过程中的细胞转运机制及影响因素进行归纳总结。结果与结论:共检索到相关文献488篇,其中有效文献44篇。阳离子型纳米载体在递送抗肿瘤药物过程中的细胞转运过程包括细胞摄取、胞内转运、细胞外排3个过程。细胞摄取机制包括能量依赖的内吞作用和细胞膜打孔,其影响因素有阳离子型纳米载体及其给药系统的粒径、肿瘤细胞的种类;胞内转运机制即阳离子型纳米载体被摄取后部分转运至溶酶体,部分避开溶酶体转运至细胞浆或其他细胞器,其是否转运进入溶酶体主要由内吞途径决定;细胞外排机制即阳离子型纳米载体通过外泌体、溶酶体降解和内质网-高尔基体-细胞膜途径被排出肿瘤细胞,其影响因素有肿瘤细胞种类和阳离子型纳米载体的粒径、形状及其在细胞内的分布。细胞内部分细胞器具有带电荷的膜结构,阳离子型纳米载体可能会与细胞器膜发生静电作用,从而影响其靶向作用,但该作用机制仍需要进一步深入研究,以期为开发靶向性更强、抗肿瘤效果更好的肿瘤靶向给药系统提供参考。

重组腺相关病毒-阳离子脂质体载体的构建及评价

目的探讨重组腺病毒相关病毒(rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)复合载体的构建方法及其转染率评价。方法构建rAAV-GFP,rAAV-LyoVec复合载体及rAAV-GFP-LyoVec。倒置荧光显微镜观察,测定rAAV-GFP,LyoVec-GFP及rAAV-GFP-LyoVec对定量C6细胞的转染率,筛选出高转染率载体。结果rAAV-GFP组24、48、72和96h转染率分别为16%、23%、21%和9%;LyoVec-GFP组为28.5%、33%、32%和11%;rAAV-GFP-LyoVec组为49%、59%、64%和20%。rAAV-GFP-LyoVec组分别在24、48、72和96h的转染率显著高于rAAV-GFP组(P<0.01)及LyoVec-GFP组(P<0.01)。结论新构建rAAV-LyoVec复合载体基因的转染效率远远高于rAAV或LyoVec独立转染。

原子力显微镜研究阳离子脂质基因载体的结构表征

目的:通过原子力显微镜观察阳离子脂质基因载体(lipid-mu peptide-DNA,LMD)和经过肿瘤靶向肽修饰的LMD(targeted-LMD,tLMD)的结构表征。方法:将腺病毒DNA包装肽mu与质粒DNA混合制备纳米粒子mupeptide-DNA(MD),再将MD与空白脂质体混合孵育制备LMD。将LMD与修饰有靶向配体分子的脂质分子胶束溶液共同孵育得到tLMD。将样品母液按一定比例稀释后滴在云母片上,完全干燥后使用原子力显微镜观察样品粒子的外观。结果:多肽mu可以高效地中和浓缩质粒DNA,形成的MD粒子分布均匀,平均粒径为(95±10)nm。MD粒子与空白脂质体混合继而可以得到圆润紧实、分布均匀、粒径为(140±15)nm的阳离子脂质基因载体LMD。LMD粒子与靶向肽脂质分子共同孵育后,tLMD粒子在保持结构上完整性的同时表面光滑度较LMD减小。结论:原子力显微镜可快速有效地观测到各种脂质基因载体的粒子大小、外观等,为分析脂质基因载体的物理化学性质提供了一种研究方法。

细胞种类对阳离子脂质体介导基因转染的影响

[目的]为非病毒载体阳离子类脂的研究提供参考。[方法]以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体,通过DNA延滞试验和质粒转染试验,研究Lipofectamine 2000对不同细胞(HeLa cell、B16 cell、MCF-7 cell和SW-480 cell)的转染效率,将其与其他转染试剂Sofast和DOTAP进行比较,并探讨细胞种类对Lipofectamine 2000转染效率的影响。[结果]随着复合物中转染试剂比例的增加,DNA延滞作用明显增强。当Lipofectamine 2000与DNA的质量比增至51:时,仅有小部分DNA移出原点。Lipofectamine 2000对SW-480cell的转染效率明显高于其他3种细胞。Lipofectamine 2000对B16细胞株的转染效果要优于Sofast,而Sofast与DOTAP的转染效果相当。[结论]Lipofectamine 2000对多数细胞具有较高的转染效率,并不适合所有类型的细胞。

聚谷氨酸为骨架的梳状基因载体的合成及生物学性能评价

以聚谷氨酸为骨架,用低分子量聚乙烯亚胺胺解聚谷氨酸苄酯,得到聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺,用异佛尔酮二异氰酸酯将聚乙二醇单甲醚偶联到聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺上,合成了梳状聚阳离子基因载体聚谷氨酸-g-(聚乙烯亚胺-b-聚乙二醇).利用核磁共振氢谱、激光粒度分析仪、Zeta电位仪和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒脱氧核糖核酸(pDNA)形成的复合物进行了表征.通过噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1及荧光素酶质粒pGL3体外转染实验考察了载体的细胞毒性及基因转染效率.结果表明,当聚乙烯亚胺中N原子和DNA中P原子的摩尔比(N/P)大于5时,载体能很好地包裹DNA,载体与DNA形成的复合物粒径约为130 nm,Zeta电位约为28 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和较高的转染效率.

rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53治疗C6胶质瘤

目的探讨重组腺病毒相关病毒(recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)载体介导血管抑素(Angiastain)及野生型P53(wild typeP53)联合基因治疗C6胶质瘤。方法构建新型载体rAAV-LyoVec,建立裸鼠C6胶质瘤模型,观察各组不同时间肿瘤体积变化,免疫组织化学分析血管抑素、野生型P53及相关蛋白产物的表达情况,RT-PCR确认血管抑素基因在分子水平表达,电镜观察C6细胞凋亡、病毒转染、组织坏死等,从组织,细胞,蛋白,分子水平研究rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53联合治疗C6胶质瘤的有效性。结果rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53基因联合治疗C6胶质瘤,对比血管抑素及野生型P53单基因治疗效果显著(P<0.05),免疫组织化学检测各组细胞P53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表达。RT-PCR法检测血管抑素在rAAV-angiastain-LyoVec组及rAAV-P53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec组表达。结论联合基因治疗是治疗脑胶质瘤的有效方法。

SP94修饰的肝靶向阳离子基因载体的制备及其体外评价

目的:研究适配体SP94修饰的阳离子基因载体H_3R_5,合成新型肝靶向纳米复合物SP94-H_3R_5/miR195,增加对肝癌细胞的靶向性,提高基因的转染效率。方法:经半胱氨酸修饰的SP94与H_3R_5末端的半胱氨酸发生氧化反应,组装得到SP94-H_3R_5,利用~1 H-NMR鉴定SP94-H_3R_5载体的结构,通过电位粒度仪测定纳米复合物的电位和粒径,利用琼脂糖凝胶电泳考察载体对miR195的压缩能力。以体外培养的人肝癌SK-Hep-1为研究对象,CCK8法检测SP94-H_3R_5和H_3R_5对细胞增殖的抑制作用,采用激光共聚焦显微镜考察肝癌细胞对纳米复合物的摄取,以pEGFP为报告基因考察基因转染效率,Western blot实验检测SK-Hep-1细胞VEGF的蛋白表达。结果:SP94-H_3R_5具有生物相容性,可以压缩miR195形成稳定的纳米复合物,SP94-H_3R_5/miR195与H_3R_5/miR195相比可以更多地被SK-Hep-1摄取(P<0.01),SP94-H_3R_5转染效率高于非靶向载体H_3R_5,对VEGF的阻滞作用也更高(P<0.01)。结论:SP94-H_3R_5兼具纳米材料的被动靶向作用和适配体的主动靶向作用,有潜力成为肝癌治疗中的新型载体。

非对称修饰柱[5]芳烃的合成及其用于阳离子基因载体的研究

目的构建一种非对称修饰的柱[5]芳烃并探究其在阳离子基因载体方面的应用潜力。方法利用柱[5]芳烃多化学修饰位点易于功能化、稳定性好、生物安全性高等独特优势, 设计一种基于单侧低分子量PEI非对称修饰的柱[5]芳烃用于DNA的负载, 进一步引入靶向基团甘露糖构建新型的基因载体材料, 并以此形成较为通用的模板。结果成功构建基于柱[5]芳烃的高效基因治疗载体系统。根据核磁氢谱结果分析, 目标产物的合成符合预期。凝胶电泳实验中, 从W/W比0.3开始, P5-PEI1.8K完全阻滞了DNA的迁移;从W/W比0.5开始, P5-PEI1.8K-M完全与DNA复合。在复合物的粒径和电势的表征中, 不同重量比下粒径均在300 nm以内, 复合物的最大电势在25 mV左右。体外细胞毒性的实验结果显示PEI, P5-PEI1.8K, P5-PEI1.8K-M的毒性依次降低。选取甘露糖受体高表达的MDA-MB-231细胞, 通过荧光素酶的活性转染实验, P5-PEI1.8K-M的转染效率随重量比逐渐提高, 在W/W为6~7时达到最高值, 并接近PEI25K的水平;以W/W=7为最佳比例, 通过荧光蛋白的表达来进一步定性考察载体的转染效率, 证实甘露糖的引入确实加强了载体材料的转染效率。结论以柱芳烃类化合物作为模板, 合理引入客体分子, 通过主客体组装可得到形貌丰富、功能多样的载体材料。

用作基因传递系统的阳离子纳米载体的细胞毒性及其机制研究进展

作为基因治疗中的非病毒基因载体,阳离子纳米载体可通过电荷作用与核酸类药物相结合,具有广阔的应用前景。然而,其细胞毒性,主要表现为诱导细胞凋亡,限制了其临床开发与应用,也成为阳离子纳米载体研究所关注的重点。揭示和准确评价阳离子纳米载体的细胞毒性及其机制,将有助于设计和开发更安全、更高效地用于基因传递的阳离子纳米载体。综述常用作基因传递系统的阳离子纳米载体材料阳离子脂质体、聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、聚苯乙烯纳米粒以及其他阳离子聚合物的细胞毒性及其机制研究进展。

白芨多糖在药剂领域的应用

寻找理想的新型药物递送载体材料一直是药学领域的研究热点。白芨多糖是一种新型的天然高分子材料,作为制剂材料在药剂领域有着广泛的应用前景。本文对近十余年来国内外以白芨多糖及白芨多糖衍生物为制剂材料、药物载体,尤其是作为血管栓塞材料、基因载体和聚合物胶束材料在抗肿瘤药物递送领域的文章进行综述,以期为白芨多糖相关领域的科研工作者提供参考。

BPEI／miRNA、PAMAM／miRNA和PEI／miRNA治疗前列腺癌作用研究

目的利用分枝状聚乙烯亚胺(BPEI)、树枝状聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)和线型的聚乙烯亚胺(LPEI)包载具有抑制前列腺癌细胞LNCa P增殖、侵袭和转移的miRNA-15a和miRNA-16-1构建3种聚阳离子纳米复合物,对其抑制LNCa P细胞作用进行考察。方法利用粒径分析仪测定3种纳米复合物的粒径Zeta电位,利用凝胶电泳实验测定载体材料包裹miRNA的稳定性;利用荧光显微镜和流式细胞仪考察3种复合物对LNCa P细胞的转染效率;CCK8法测定抑制LNCa P细胞增殖效果;Western blot法测定BCL-2、Cyclin D1和Wnt3a蛋白表达效果。结果分枝状聚乙烯亚胺,树枝状聚合物聚酰胺-胺和线型的聚乙烯亚胺3种材料包裹miRNA可形成稳定的纳米复合物,在N/P=5时,分枝状聚乙烯亚胺/miRNA-CY3对LNCa P的转染效率高于树枝状聚合物聚酰胺-胺/miRNA-CY3和线型的聚乙烯亚胺/miRNA-CY3,具有统计学意义(P<0.01)。分枝状聚乙烯亚胺、树枝状聚合物聚酰胺-胺和线型的聚乙烯亚胺都可以携带miRNA-15a和miRNA-16-1进入LNCa P细胞,并且阻滞LNCa P细胞中BCL-2、Cyclin D1和Wnt3a蛋白的表达。结论分枝状聚乙烯亚胺、树枝状聚合物聚酰胺-胺和线型的聚乙烯亚胺3种材料包裹miRNA-15a和miRNA-16-1可形成稳定,并且对前列腺癌细胞LNCa P细胞具有高转染效率的纳米系统。并可以有效阻滞LNCa P细胞中BCL-2、CCDN1和Wnt3a蛋白的表达,有望成为治疗前列腺癌的基因给药系统。

载miR-15-a基因纳米复合物的制备及其抗前列腺癌作用的体外研究

目的基于二硫键交联合成精氨酸-组氨酸(HRss)阳离子聚合物,构建新型纳米复合物HRss/miR-15-a,用于前列腺癌研究。方法利用~1H-NMR鉴定HRss2/miR-15-a载体的结构,通过电位粒度仪测定纳米复合物的电位和粒径,利用琼脂糖凝胶电泳考察载体对miR-15-a的包裹能力。以体外培养的前列腺癌干细胞RC-92a/h TERT为研究对象,CCK8法检测3种纳米复合物对细胞增殖的抑制作用,以p EGFP为报告基因考察基因转染效率,利用Transwell小室考察HRss/miR-15-a对细胞运动能力的影响。结果细胞毒性试验结果显示,载体材料对正常及肿瘤细胞毒性较低,可以包裹miR-15-a形成稳定的纳米复合物,HRss2/miR-15-a相较于HRss1/miR-15-a和HRss3/miR-15-a,转染效率更高,对前列腺癌干细胞的运动能力影响也更大。结论 HRss可以运载基因药物,体外评价效果最佳的HRss2,有潜力成为抗前列腺癌基因治疗中的新型载体。