载基因阴离子脂质体的制备及特征研究

目的:制备粒径符合要求(200nm左右)的阴离子脂质体,从处方因素和工艺因素两方面考察多种因素对所得脂质体粒径和多分散指数(PDI)的影响;并制备阴离子脂质体/DNA复合物。方法:采用薄膜超声法-膜挤压法;以粒径和多分散指数为指标(由激光粒度仪测定),处方因素选择介质的离子强度,工艺因素选择旋转蒸发的转速、探头超声的次数等因素进行考察。结果:旋转蒸发时以转速150rpm制备脂质体薄膜;探头超声时功率为200W,每超声5s间隔10s,水浴温度为25℃,超声次数30￣35次;过膜挤出次数12次。结论:使用薄膜超声法-膜挤压法可制得符合课题要求的阴离子脂质体。

阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导的基因转染

目的评价阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导质粒转移至HepG2肝癌细胞中及其毒副作用。方法制备携载表达绿色荧光蛋白质粒的阳离子脂质体,与阴离子脂质体形成复合物。测定脂质体复合物的zeta电位,凝胶阻滞实验考察质粒包封情况,流式细胞仪测量各阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物的转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果复合物能完全包裹质粒,其zeta电位低于阳离子脂质体zeta电位;脂质体复合物介导的转染效率略低于阳离子脂质体,其细胞生存率高于阳离子脂质体。结论阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物在降低细胞毒性的同时,可实现对HepG2细胞较高的转染效率。

叶酸靶向anti-miR-221阴离子脂质体的制备及体外抗肿瘤作用

目的基于阴离子脂质体制备一种叶酸靶向miR-221反义寡核苷酸(anti-miR-221)递送系统,并初步评价其体外抗肝癌效果。方法采用薄膜分散水化法制备叶酸靶向anti-miR-221脂质体(FRL),测定其粒径、Zeta电位和包封率。以钙黄绿素为模型药物,通过体外细胞摄取实验观察所制叶酸靶向阴离子脂质体在人肝癌HepG_(2)细胞中的靶向递送效果。利用流式细胞术检测FRL对HepG_(2)细胞凋亡和周期的影响。结果所制FRL的粒径为(172.70±3.76)nm,Zeta电位为(-1.16±0.15)mV,包封率为(83.53±1.85)%。体外细胞摄取实验结果显示,叶酸靶向阴离子脂质体成功将模型药物钙黄绿素递送至HepG2细胞中,且递送效率高于普通非靶向脂质体(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,FRL作用后细胞的凋亡率显著高于普通非靶向脂质体作用后的细胞(P<0.01)。细胞周期检测结果显示,FRL可使细胞的S期缩短,并将细胞阻滞于G_(0)/G_(1)、G_(2)/M期。结论FRL可以较好地包封anti-miR-221,并成功将其递送至肝癌HepG_(2)细胞中,而且在诱导细胞凋亡和细胞周期调控方面呈现出良好的体外抗肝癌效果。

阴离子脂质体介导的腺病毒/卡莫司汀共转运系统载药量测定

目的建立一套有效可靠的检测方法,以测定阴离子脂质体介导的腺病毒和化疗药卡莫司汀共转运载体系统中腺病毒和卡莫司汀的含量。方法以钙离子融合法制备共转运载体复合物;根据腺病毒(Ad5)的hexon基因序列设计用于Taqman探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)的引物和探针序列,优化反应体系,从而准确测定腺病毒含量;优化色谱条件,建立针对共转运载体复合物检测卡莫司汀含量的高效液相色谱法。结果以荧光定量聚合酶链式反应法测得共转运载体复合物中腺病毒载药量为(23.2±1.8)%;高效液相色谱法测得卡莫司汀在共转运载体复合物中的载药量为(55±2.8)%。结论本实验成功建立了分别用于测定共转运载体系统中腺病毒和卡莫司汀含量的荧光定量聚合酶链式反应和高效液相色谱法;这两种检测方法操作简便、准确可靠,具有一定的普遍适用性。

腺病毒-阴离子脂质体复合物的制备和体外表征

为了制备腺病毒-阴离子脂质体复合物(AL-Ad5),首先利用HEK 293细胞大量扩增了带有绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒,并以氯化铯两步密度梯度离心法进行纯化,再通过细胞病变效应(CPE)法、壳蛋白免疫法和定量聚合酶链反应(Q-PCR)法分别测定腺病毒滴度。以中心组合设计法优化处方和制备条件,通过钙离子融合法制备目标复合物AL-Ad5,以透射电镜和动态光散射法分别对其外观形态、粒径和zeta电位进行考察;并制备双色荧光标记的复合物,通过激光共聚焦技术观察该复合物被MDCK细胞摄取后的胞内定位,以考察阴离子脂质体对腺病毒的包合情况。结果表明,目标复合物分布均匀,粒径和zeta电位分别为(211±10)nm和(-41.2±2.2)mV。激光共聚焦实验结果表明,红色荧光标记的腺病毒和绿色荧光标记的脂质体在MDCK细胞内的定位一致。由此说明,阴离子脂质体能够较好地包裹腺病毒以形成腺病毒-阴离子脂质体复合物。

PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物的制备及分离纯化

目的制备并分离纯化PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。方法采用薄膜分散法制备空白阴离子脂质体,利用钙离子融合法制备阴离子脂质体与腺病毒的复合物,最后用后插入法制备PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。通过蔗糖密度梯度离心法分离制备的复合物,分别测定分离得到的各组分中脂质体、PEG-脂质材料及腺病毒的含量。结果成功制备了PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物,连接到脂质体上的PEG-脂质占加入总量的28.9%,被脂质体包裹的腺病毒占加入量的35.9%。结论通过蔗糖密度梯度离心可得到纯化的PEG修饰的腺病毒-阴离子脂质体复合物。

腺病毒及紫杉醇阴离子脂质体共传递复合物的制备及体外细胞转染

目的制备腺病毒及紫杉醇阴离子脂质体(AL-Ad5-PTX)共传递复合物,考察该复合物物理性质及体外细胞转染效率。方法先后用薄膜超声法和钙离子融合法制得AL-Ad5-PTX;测定AL-Ad5-PTX中紫杉醇的含量;测定粒径及电位;用透射电镜观察其形态;以表达荧光素酶的重组腺病毒作为病毒载体,比较AL-Ad5-PTX和裸腺病毒(naked Ad5)在富含柯萨奇腺病毒受体(CAR)或缺乏CAR受体细胞中的转染效率。结果 AL-Ad5-PTX中紫杉醇包封率为82.70%±2.47%,粒径为241.6±2.6 nm,粒径分布为0.196±0.006,电位为-50.4±5.4 mV。AL-Ad5-PTX在两种细胞中的转染效率高于naked Ad5(P<0.05)。结论成功制备了能够同时转运腺病毒及紫杉醇的复合物AL-Ad5-PTX,能够提高naked Ad5在细胞中的转染效率;HPLC法检测AL-Ad5-PTX中紫杉醇含量,操作简便、准确、可靠。

血清因素对阳离子脂质体转染的影响及其对策

由于大多数阳离子脂质体在血液中的稳定性差,致使它们进一步运用于基因治疗的潜能没能完全发挥出来。本文阐述了血清因素影响阳离子脂质体转染的机制,阳离子脂质体与网状内皮细胞系统的关系以及目前消除血清影响的一些对策和亟待改进之处。

阴离子长循环脂质体在瘤鼠体内分布和反义显像

建立乳腺癌模型,了解游离的131I-bcl-2/bcl-xlASON(FA)以及阴离子长循环脂质体包裹的131I-bcl-2/bcl-xlASON(NA)在瘤鼠体内组织分布。SD大鼠尾静脉注射N-甲基亚硝基脲溶液,诱导建立乳腺癌模型。NA和FA分别静脉注射后0.5、1、2、3、4、6、12和24 h,断头处死瘤鼠,取其组织器官测量,计算每克组织放射性计数占注入剂量的百分数(%ID/g)。计算瘤鼠肿瘤/血液或肿瘤/肌肉比值。分别静脉注射0.4 mCi NA1、31I-错配序列阴离子长循环脂质体(NS)和131I-无义序列阴离子长循环脂质体(NN)后0.5、1、2、3、6和12 h,进行瘤鼠全身前后位静态显像。MNU致瘤时间为(96±1.2)d,SD大鼠致癌率为70%(90/130),组织学类型为乳腺癌。注射后10 h,NA在瘤鼠肿瘤组织、肝和脾内的分布分别为(6.23±0.23)%ID/g、(12.00±0.26)%ID/g和(18.25±1.33)%ID/g。肿瘤/血液和肿瘤/肌肉比值分别为6.29±0.76和10.55±0.68。NA注射后10 h,肿瘤显示最佳。NS和NN注射组瘤鼠肿瘤显示不清。NA体内清除率低,体内循环时间长,肿瘤部位浓聚增加,提示NA很可能提高放射反义治疗疗效。