钙激活氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用

目的:研究钙激活氯离子通道及其通道阻断剂尼氟灭酸(niflumic acid,NFA)i、ndaryloxyacetic acid(IAA-94)在苯福林(phenylephrine,PE)引起的肺动脉收缩中的作用。方法:常规离体血管灌流法检测肺动脉环张力;采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),观察NFA和IAA-94对PE诱导的PASMCs胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,用荧光分光光度计法检测[Ca2+]i。结果:钙激活氯离子通道阻断剂NFA和IAA-94可以舒张PE引起的肺动脉环收缩;NFA和IAA-94对KCl引起的血管收缩无影响;PE可以引起[Ca2+]i升高,NFA和IAA-94对PE诱导[Ca2+]i升高无影响。结论:钙激活氯离子通道在生理状态下与血管活性药(PE)引起的肺动脉张力变化有关,这为研究其在低氧肺血管收缩中的作用提供了新的线索。

尼氟灭酸对大鼠心室肌细胞钠通道及动作电位的影响

目的:观察尼氟灭酸(niflumicacid,NFA)对大鼠心室肌细胞钠电流及动作电位的影响。方法:分别用全细胞膜片钳及电流钳技术记录单个心室肌细胞电压门控钠电流(INa)和动作电位(AP)。结果:尼氟灭酸(100μmol/L)能可逆性地抑制INa和AP,与对照组比较,抑制的程度分别为:60.1%±12.1%(-30mV,n=6,P<0.01)及78.2%±10.3%(n=5,P<0.01)。天冬氨酸根离子(Asp-)替代细胞外液的氯离子可引起类似尼氟灭酸的作用。结论:尼氟灭酸对钠通道有抑制作用并影响动作电位。

慢病毒转染荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L细胞模型的构建

目的构建稳定表达EYFP荧光蛋白的HeLa细胞作为阴离子(卤素)通道阻断剂筛选的细胞模型,为高通量筛选阴离子(卤素)通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞产生慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选,纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP-H148Q/I152L的表达效率。并验证EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT-PCR和Western blot检测结果显示,目的基因在HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到EYFP-HeLa稳转细胞株能够表达特有的EYFP黄色荧光,效率接近100%。碘离子(I-)(低渗)溶液刺激细胞阴离子(卤素)通道的开放,内流的I-能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP-HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白,对内流入细胞的I-敏感,可以作为理想的阴离子(卤素)通道阻断剂的筛选模型。