通过阵列式标签高通量测序高效鉴定点突变单克隆细胞

目的建立阵列式标签标记的高通量测序方法并结合多克隆预筛选实现对点突变单克隆细胞株的高效鉴定。方法通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复(HDR)在K562细胞的rs826415位点引入G到T点突变。侯选细胞按每孔10~20个的密度接种培养多克隆,以带有标签(barcode)的引物区分各多克隆细胞,PCR扩增含rs826415位点的区段,产物合并进行二代测序。生物信息学分析各多克隆细胞的同源重组率及插入/缺失率。将阳性率最高孔内的细胞进一步单克隆培养并鉴定基因型。结果通过CRISPR/Cas9同源重组法和有限稀释获得96个rs826415位点打靶的多克隆细胞。经阵列式标签高通量测序法分析各孔细胞同源重组且不伴随插入/缺失(HDR without indel)的比率,96个多克隆的平均阳性率为0.21%,最高达4.35%,将该多克隆细胞进一步单克隆培养,从30个单克隆中成功获得rs826415位点由G/G突变为T/G的杂合型细胞株。结论通过阵列式标签高通量测序策略结合多克隆细胞预筛选,实现了定点突变单克隆细胞株的高效鉴定,相比常规方法显著降低了工作量和成本。

用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建

利用第二代测序技术测定海洋生物转录组已成为揭示海洋生物分子生物学机制的重要工具.以长度为10nt的不同多重标签(multiplex identifier)进行区分,构建了杂色鲍(Haliotis diversicolor)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)3种海洋生物的12个多重标签转录组文库.以合适的比例对各文库进行混合,利用定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000等3种DNA浓度测定方法测定每个多重标签转录组文库的DNA浓度,3种方法的数值均一化并加权平均后,按照预定比例混合.为评估文库质量,先采用传统的Sanger测序测定了混合文库的192条序列,发现191条序列具有符合Roche/454高通量测序要求的AB格式,即一端为454A序列,另一端为454B序列;其中189条序列能分辨出其带有的多重标签;插入的平均长度为348bp.然后通过Roche/454的滴定测序获得了34642条序列,其中32872条序列(94.9%)能分辨出其带有的多重标签,能够精确地分配到12个转录组,并且利用滴定测序结果计算出每个转录组文库的真实比例,对定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000进行了评估,结果表明定量PCR是相对准确的定量方法.以上的评估表明所建立的转录组文库构建方法是稳定可靠的,可以广泛应用于转录组学研究.

高通量测序与染色体微阵列分析在308例早期流产中的应用

目的:探讨高通量测序(CNV-seq)与染色体微阵列分析(CMA)在早期自然流产遗传学诊断中的应用价值。方法:选取2016年1月至2019年11月在山东大学齐鲁医院就诊的308例早期自然流产孕妇,取其绒毛组织,提取DNA。155例样本行CMA检测,153例样本行CNV-seq检测。结果:CMA组检测失败率(10.32%)显著高于CNV-seq组(0%),差异有统计学意义(P<0.05)。CNV-seq组对染色体异常核型的阳性检出率为53.59%,与CMA组(56.83%)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。CNV-seq对染色体拷贝数变异(CNVs)的检出率为10.46%,显著高于CMA组(4.32%)(P<0.05)。结论:CNV-seq对早期流产组织的染色体异常核型的阳性检出率与CMA相当,但对样本质量和浓度的要求明显较低,且在CNVs的检出率上有明显优势。表明CNV-seq在临床查找早孕期自然流产病因方面有更好的应用前景。

基于高通量测序的石斑鱼循环水养殖生物滤池微生物群落分析

为了解循环水养殖系统生物过滤器内微生物群落结构,明确其内部微生物的多样性。该文采用Illumina-Mi Seq高通量测序技术对石斑鱼循环水养殖系统3级浸没式生物滤池内微生物群落结构及多样性进行分析。研究结果表明:3个浸没式生物滤池的样品分别获得712,635,865个Operational Taxonomic Unit(OTU),共同包含的OTU为488个,其中3号滤池的微生物群落丰富度和多样性高于1号和2号生物滤池,且1号生物滤池和2号生物滤池内微生物群落结构相似度较高。在门的水平,3个滤池以变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes为优势菌;在属的水平,发现3个滤池中起硝化作用的细菌主要是亚硝化单胞菌Nitrosomonas和硝化螺菌Nitrospira。该试验为揭开生物滤池这个"黑匣子"提供数据基础,对研究海水循环水养殖生物滤池的构建及其脱氮效率具有重要的指导意义。

高通量测序技术在无创性产前胎儿染色体缺失重复检测中的应用

目的:探讨高通量测序技术在无创性产前胎儿染色体缺失重复检测中应用效果。方法:收集2016年8月—2018年8月本院行无创产前检测的自然受孕单胎孕妇5170例,在孕12~22周采集孕妇外周静脉血行无创性产前胎儿染色体检测,对提示染色体缺失重复者行产前遗传咨询,经孕妇及其家人知情同意后孕18~24周行羊水细胞培养染色体核型分析和微阵列检测,分析无创性产前胎儿染色体检测与染色体核型及微阵列分析结果的符合率。结果:无创产前检查提示染色体缺失重复病例27例均接受了羊水穿刺,检出染色体异常11例,其中9例与染色体微阵列结果相符(33.3%);不相符2例微阵列结果提示为多态性。无创产前检查提示性染色体异常12例中11例接受羊水穿刺,检出胎儿性染色体异常7例,符合率63.64%。结论:高通量测序无创性产前检测技术对产前胎儿染色体缺失重复的筛查具有临床价值,但针对染色体缺失重复及性染色体异常检测的临床符合率不高,当提示染色体异常时必须行有创性产前诊断(染色体核型分析或微阵列分析)。

高通量测序技术检测非小细胞肺癌相关驱动基因的突变

目的:探讨高通量测序技术在非小细胞肺癌驱动基因检测中的应用。方法:应用Ion Torrent高通量测序平台,检测150例非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2和PIK3CA基因突变,并利用Sanger测序法和微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法检测150例NSCLC患者EGFR基因突变,对结果进行对比分析。结果:EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2和PIK3CA基因突变检出率分别为51.33%(77/150)、7.33%(11/150)、1.33%(2/150)、1.33%(2/150)、2.00%(3/150)和4.67%(7/150)。57例标本未检出任何基因突变,84例标本检出单个驱动基因发生突变。9例标本检出2个及以上驱动基因发生突变。Sanger测序法检测EGFR基因突变,突变检出率为38.67%(58/150),与高通量测序法比较,差异有统计学意义(χ^(2)=4.862,P=0.027),高通量测序法的灵敏度为98.28%,特异度为78.26%。ddPCR法突变检出率为50.00%(75/150),与高通量测序法比较,差异无统计学意义(χ^(2)=0.053,P=0.818),阳性一致率为82.67%,阴性一致率为80.00%,总一致率为81.33%。结论:高通量测序法更适合应用于NSCLC诊疗,Sanger测序法和ddPCR法可作为有益的补充。

基于Edlib的启发式生物序列聚类算法

目的提出一种基于Edlib的启发式序列聚类算法:EdClust,以降低目前启发式序列聚类算法普遍存在的聚类数量过估计和聚类种子序列质量低的问题。方法EdClust首先读取第一条序列并作为第一个聚类单元的种子;然后读取下一条序列,通过Edlib计算序列与种子序列的相似性,如果相似性大于给定阈值,则对其进行聚类,否则,创建一个新的聚类单元并作为其种子序列;重复以上步骤,直到所有序列完成聚类。结果2组实验测试表明,EdClust在聚类数量和种子序列质量上均取得较好效果。结论EdClust采用Edlib进行序列比对,可以快速得到待比对序列与种子序列间的相似性,提高了聚类种子质量,降低了聚类数量过估计。

PSORA:一种基于高通量测序的T-DNA插入位点分析方法

【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法,将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)的扩增产物进行高通量测序,随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点,该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物,另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签(Barcode),用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系(L1、L6、L9、L15和L19)由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外,通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析,结果显示,L6含2个插入位点(NW_015801367的36316 bp处和NW_015950898的42202 bp处),L9、L15和L19各含1个插入位点(L9的插入位点为NW_015943682的235969 bp处;L15的插入位点为NW_015802951的60529 bp处;L19的插入位点为NW_015863435的12188 bp处),L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证,含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照,野生型(WT)作为空白对照,结果表明,在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增,该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法,可以同时分析多个插入事件,相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。

高通量检测技术在植入前胚胎遗传学诊断中的应用

基因芯片和深度测序是两大最重要的高通量检测技术,给生物学和医学研究带来巨大的变化,在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究和遗传疾病诊断中得到了广泛的应用。随着全基因组扩增技术的不断改良,高通量技术在辅助生殖植入前遗传学诊断(PGD)中的应用有了巨大的进展。基于微阵列技术的胚胎全染色体组非整倍体筛查及结构异常的PGD已经开始临床应用,PGD/植入前遗传学筛查(PGS)后的临床妊娠率和胚胎植入率显著提高;基于单细胞高通量测序技术的染色体非整倍体及单基因病诊断的临床试验也已见报道,并有希望在不久的将来走向临床应用。

新款桌式基因组测序仪Ion Torrent发布

2011年3月17日，Life Technologies公司在北京科技会堂举行2011年生命科学新技术报告会并发布了利用半导体芯片实现高通量测序的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪。据介绍，Ion Torrent（PGMtu）作为以半导体芯片进行测序的技术平台属于基因组测序领域内的革新性产品。通过专有的大规模并行半导体感应器，

微阵列分析与高通量测序对271例胚胎停育染色体检测的比较分析

目的 以271例胚胎停育染色体检测为例,比较染色体微阵列分析与高通量测序在临床应用的优势与局限。方法 选择2017年3月-2021年8月在本院就诊确定为胚胎停育的271例患者为研究对象,74例采用CNV-Seq检测作为试验组,另外197例采用CMA检测作为对照组。结果 试验组报告阳性结果的有46例(62.16%),对照组报告阳性120例(60.91%),两者阳性率比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.04,P>0.05)。经Spearman等级相关分析发现,染色体异常率与患者年龄成正相关(r=1.00,P<0.001)。试验组和对照组前10周累积样本的染色体异常率分别为71.19%和65.73%。试验组和对照组的孕周数与染色体异常率相关(χ^(2)值分别为12.80、6.10,P<0.05)。结论 CMA及CNV-Seq技术均可有效检出胚胎停育遗传学病因,两者之间具有较好的一致性。考虑经济性,在告知技术局限性的前提下,推荐使用CNV-Seq+STR进行胚胎停育流产物分析。

大豆转化体E8A7027外源T-DNA分析及特异性检测体系建立

为进一步分析转AgGlpF基因耐盐转基因大豆E8A7027转化体的分子特征信息并对其进行特异性检测,本研究分离该转化体的旁侧序列并建立其特异性PCR检测体系。基于基因组重测序技术并结合Sanger测序技术,将基因组重测序分析获得的序列信息与参考大豆基因组进行对比,确定E8A7027转化体的T-DNA区在大豆基因组上的插入位点及其5′端和3′端的旁侧序列。根据旁侧序列设计PCR检测引物,并对检测体系的特异性、灵敏度进行实验室内验证。结果显示:转基因大豆E8A7027的整合位点为Chr09染色体的33886331位点,整合方式为单拷贝插入,受体基因组DNA在插入位点缺失了1段58 bp序列,分别获得E8A7027大豆的5′端旁侧序列910 bp和3′端旁侧序列802 bp。根据这两个旁侧序列设计引物建立的PCR检测方法,能够特异性地将E8A7027大豆转化体与其他转基因作物和非转基因大豆区分开,方法的检测灵敏度为0.05%。研究结果可为E8A7027转化体的安全评价和监管检测提供技术支撑。

“基于母血浆深度测序的胎儿亚显微染色体异常无创伤性检测”点评

1原文摘要The purpose of this study was to determine the deep sequencing and analytic conditions needed to detect fetal subchromosome abnormalities across the genome from a maternal blood sample.

基于定制协处理器的基因重测序加速技术研究

自2008年1月高通量测序技术应用以来,测序的通量和成本都在不断下降.然而基因数据的爆发式增长速度已经超过了摩尔定律,对海量数据的计算处理能力成为制约基因测序应用推广的瓶颈.以基于Hash索引的重测序算法为目标,对计算和访存行为进行分析,从而提出了一个现场可编程门阵列(field programmable gate array,FPGA)作为协处理器的架构,并在Convey公司的HC-1ex平台上进行了设计与实现.其基本处理单元内部采用全流水的设计及FIFO隔离计算模块和访存模块,可以完整执行重测序算法的核心流程.通过将基本处理单元和访存端口的一对一绑定,在4块Xilinx Virtex-6LX760上实现了64路并行处理流程,总平均读内存带宽可达22.59GBps.与8核Intel Xeon处理器相比,可以提升28.5倍的性能.

铁酸锌纳米颗粒对序批式反应器性能及微生物群落的影响

本文研究了铁酸锌纳米颗粒(ZnFe_2O_4 NPs)浓度变化对序批式反应器(SBR)性能、微生物酶活性和微生物群落的影响。结果表明:0~50mg/L的ZnFe_2O_4 NPs对COD和NH_4^+-N的去除未产生影响,出水NO_2^--N浓度接近于0mg/L,而出水NO_3^--N浓度在3.89~5.63mg/L之间变化。随着进水,ZnFe_2O_4 NPs浓度从0mg/L增加到50mg/L,活性污泥的比耗氧速率(SOUR)、比氨氧化速率(SAOR)、比亚硝酸盐还原速率(SNIRR)、脱氢酶(DHA)、氨单加氧酶(AMO)和亚硝酸盐还原酶(NIR)的活性逐渐降低。与进水ZnFe_2O_4 NPs浓度为0mg/L时相比,活性氧(ROS)产生量和乳酸脱氢酶(LDH)释放量的变化表明,ZnFe_2O_4 NPs对活性污泥中微生物有一定毒性效应。ZnFe_2O_4 NPs的浓度变化导致微生物群落种类和相对丰度在门和属水平上发生变化。该研究结果为评价ZnFe_2O_4 NPs对污水生物处理系统的潜在影响提供可靠的理论基础和技术依据。

缺血性脑卒中患者血清差异基因的筛选及生物信息学研究及验证

目的研究缺血性脑卒中患者血清差异基因的筛选及生物信息学。方法以2023年3月-2024年3月在新疆医科大学第二附属医院神经内科确诊的80例缺血性脑卒中患者为病例组,选择同期80例健康体检者为对照组。分别挑选两组各10例受试者的外周血清采用芯片差异性基因鉴定法筛选缺血性脑卒中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA),并采用KEGG通路富集和基因本体论(GO)分析鉴定差异表达基因发挥的生物学功能。挑选2个上调和2个下调的lncR-NAs,在两组患者外周血中采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测表达量,采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)计算差异性表达lncRNAs诊断缺血性脑卒中的曲线下面积(Area under the curve,AUC)。结果共检测到34个高表达和16个低表达的lncR-NAs。KEGG通道分析显示,差异表达的lncRNAs涉及肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、类风湿性关节炎、细胞因子与细胞因子受体相互作用,病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、癌症的转录失调、沙门氏菌感染、白细胞介素(IL)-17信号通路、趋化因子信号通路。GO分析显示,差异表达的lncRNAs涉及白细胞黏附调控、细胞黏附调节、白细胞与其他细胞黏附、细胞趋化性、T细胞活化、骨髓细胞分化、止血和凝血。qRT-PCR检测显示,与对照组比较,病例组患者A1BG-AS1和BRWD1-AS2表达量升高,BVES-AS1和C10ORF71-AS1表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC分析显示,A1BG-AS1、BRWD1-AS2、BVES-AS1和C10ORF71-AS1表达量诊断缺血性脑卒中的AUC分别为0.803、0.856、0.897和0.798(P<0.001)。结论缺血性脑卒中患者外周血中A1BG-AS1、BRWD1-AS2、BVES-AS1和C10ORF71-AS1基因差异性表达,可以辅助缺血性脑卒中的疾病诊断。

基于高通量测序的OMS-2对序批式反应器系统微生物群落的影响

随着纳米材料的广泛应用,越来越多的纳米材料随着废水进入污水处理厂,纳米材料对污水生物处理系统的潜在影响越来越受到重视。探讨了氧化锰八面体分子筛(manganese oxide octahedral molecular sieve,OMS-2)纳米颗粒对序批式反应器(sequencing batch reactor,SBR)中活性污泥微生物群落结构的影响;以活性艳红X-3B溶液模拟印染废水,将不同浓度的OMS-2混入稳定运行的SBR中,采用Illumina MiSeq高通量测序分析技术,对不同SBR中微生物分布规律进行了研究。结果表明:SBR添加0.25 g·L^-1的OMS-2后,其COD去除率和脱色率分别提升了6%和13.6%;Illumina MiSeq高通量测序显示,在混入0.25 g·L^-1的OMS-2后,SBR内污泥菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)的微生物DNA序列操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)分别增加了16.8%和96.4%,这2类菌种可能提升了SBR降解有机污染物的能力;不同浓度的OMS-2改变了菌群的多样性和结构,低浓度的OMS-2可以提升微生物菌群的多样性和改变菌群的结构。X射线光电子能谱(XPS)分析表明,OMS-2在SBR中存在锰(Ⅳ)/锰(Ⅲ)转变为锰(Ⅱ)的氧化还原反应,该过程可能影响了菌群的组成。研究为纳米材料的实际应用和环境风险提供了参考。

染色体微阵列和高通量测序技术在流产胚胎检测中的应用

目的探讨染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)和高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术在流产病因诊断中的应用价值。方法收集自然流产样本242例,对其进行CMA或NGS检测。结果242例样本检测成功238例(98.35%)。共检出染色体异常143例,占60.08%,其中染色体数目异常133例(93.01%),结构异常9例(6.29%),单亲二倍体1例(0.70%)。结论CMA和NGS均具有高通量、高覆盖度、高分辨率和快速等优点,可成为流产胚胎病因检测的新方法。CMA对于整倍体异常和单亲二倍体的检测优势更为突出,NGS在检测通量、低比例嵌合及经济方面独具优势,可为临床医师提供更多选择。

基于高通量测序的红豆杉EST-SSRs标记研究

目的:利用高通量测序,对红豆杉Taxus cuspidata转录组进行EST-SSRs发掘和研究。方法:提取红豆杉叶片cDNA,应用454 GS FLX Titanium测序,采用Newbler Assembler Software软件对序列(high-quality sequences)进行从头拼接,获得一致性序列(unique sequences)。用Simple Sequence Repeat Identification Tool(Perl Script)对一致性序列进行分析,检索SSRs模体;采用PRIMER3设计扩增引物。结果:高通量测序获得红豆杉81 148条ESTs,经拼接得到20 557条unique se-quences,从中发现了753个EST-SSRs。依据其邻近序列设计引物,共有519条EST-SSRs获得了扩增引物。在红豆杉EST-SSRs中随机挑选序列构建小样本,克隆测序结果表明87.5%的序列与Sanger测序结果一致。结论:首次获得了红豆杉属EST-SSRs,为红豆杉的种质资源培育、功能基因及基因组差异研究奠定了基础。

151例高通量测序无创产前筛查高风险胎儿的产前诊断结果分析

目的评估联合应用胎儿染色体核型分析及染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）明确151例高通量测序无创产前筛查（noninvasive prenatal screening，NIPS）提示高风险的病例的临床意义。方法以高通量测序NIPS提示胎儿13、18、21、性染色体非整倍体高风险以及胎儿染色体拷贝数变异（copy number variations，CNVs）高风险、需进行产前诊断的孕妇为研究对象。在征得知情同意后，经羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺获取胎儿细胞，进行染色体核型及CMA分析。结果在151例胎儿中，有142例为非整倍体高风险，其中21三体高风险83例、18三体高风险17例、13三体高风险2例、性染色体非整倍体高风险40例，经染色体核型和CMA分析确认21三体81例、18三体15例、47，XXY10例、47，XXX4例、47，XYY2例、46，X，del（X）（q26．1）1例，其余2例21三体高风险、2例18三体高风险、2例13三体高风险、23例性染色体非整倍体高风险病例经染色体核型和CMA检测均为46，XN；另外9例高通量测序提示CNVs高风险，其中13号染色体微缺失1例、18号染色体微重复1例、18号染色体部分缺失1例均经CMA证实，1例2号染色体重复30Mb合并8号染色体重复25Mb病例CMA未发现拷贝数变异，胎儿脐血染色体核型为46，XX，dup（2）（p23．Ip25．3）[13]／46，xx[87]，其余5例经检测均未见异常。结论高通量测序NIPS高风险的胎儿，仍有必要通过介入性产前诊断进行胎儿染色体核型联合CMA分析，以区分真阳性与假阳性的结果。