脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善阿尔茨海默病大鼠认知功能

背景:研究发现脑源性神经营养因子(BDNF)修饰的人间充质干细胞可用于治疗脊髓损伤和创伤性脑损伤等,但对阿尔茨海默病是否有疗效,既往鲜有报道。目的:观察脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和海马胆碱乙酰转移酶、基底前脑神经生长因子表达的影响。方法:40只健康雄性成年SD大鼠随机分为对照组、模型组、hAMSCs组、BDNF-hAMSCs组,每组10只。采用双侧海马注射β-淀粉样蛋白25-35构建阿尔茨海默病模型,第14天后侧脑室注射10μL的hAMSCs或10μL的脑源性神经营养因子转染hAMSCs。移植后2周,采用Morris水迷宫测试评价大鼠学习记忆能力,免疫组化法检测海马胆碱乙酰转移酶的表达,RT-PCR检测基底前脑神经生长因子mRNA的表达。结果与结论:①Morris水迷宫测试第3,4,5天时,hAMSCs组和BDNF-hAMSCs组逃避潜伏期均低于模型组(P<0.05);测试第4,5天时,BDNF-hAMSCs组逃避潜伏期低于hAMSCs组(P<0.05);②模型组海马胆碱乙酰转移酶阳性神经元数、基底前脑神经生长因子表达量明显低于对照组(P<0.05);hAMSCs组和BDNF-hAMSCs组海马胆碱乙酰转移酶阳性神经元数、基底前脑神经生长因子表达量均高于模型组(P<0.05),并且BDNF-hAMSCs组高于hAMSCs组(P<0.05);③结果表明,用脑源性神经营养因子修饰hAMSCs可进一步提高hAMSCs治疗阿尔茨海默病的认知功能,并且可以明显提高海马胆碱乙酰转移酶和基底前脑神经生长因子的表达水平。

脑源性神经营养因子修饰的神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠的学习及p75表达的影响

目的研究脑源性神经营养因子(BDNF)修饰的神经干细胞(NSC)移植对阿尔茨海默病大鼠的学习及p75表达的影响。方法 36只SD成年大鼠被选为受试对象。采用Aβ1-40立体定向注射法制作阿尔茨海默病模型(AD),并将AD模型大鼠随机分为3组:BDNF修饰的神经干细胞(BDNF-NSC)移植组、神经干细胞移(NSC)植组和溶剂(Vehicle)对照组(n=6),然后分别向这3组大鼠的海马区注入500μl的BDNF-NSC悬液(5×105)、NSC悬液(5×105)和相同剂量的不含细胞的培养基。注射4w后,采用Y迷宫方法检测AD大鼠的空间学习和记忆能力,随之用过量麻醉的方法处死受试大鼠,立即取脑并分别采用免疫组织化学方法检测BDNF-NSC在海马区的表达和Western blot法检测p75蛋白在海马区的表达。结果 BDNF-NSC组大鼠的行为学能力较NSC组和Vehi-cle组明显提高(P<0.05),同时免疫组化检测显示在海马区的BDNF-NSC阳性细胞数明显增多而Western blot检测显示p75蛋白在该区的表达显著降低(P<0.05)。结论 BDNF修饰的神经干细胞能够通过抑制海马区p75表达来防止由Aβ1-40造成的神经损害。

中药复方脑益康干预阿尔茨海默病模型小鼠脑组织神经生长因子及脑源性神经营养因子mRNA的表达

目的:观察中药复方脑益康对阿尔茨海默病模型小鼠脑组织脑神经生长因子、脑源性神经营养因子mRNA表达的影响,。方法:①实验于2004-10/2005-03在南通大学基础医学院病理生理学实验室完成。②采用D-半乳糖和亚硝酸钠腹腔注射建立阿尔茨海默病小鼠模型,ICR小鼠120只,采用随机数字法分为6组,正常对照组,模型对照组,脑复康对照组[0.4g/(kg·d)],脑益康小、中、大剂量组[(2.4,7.2,24g/(kg·d)]。脑益康由制首乌、巴戟天等组成(南通市中医院制剂室制成颗粒剂,每克颗粒剂含生药1.98g)。模型对照组、各给药组腹腔注射10g/LD-半乳糖120mg/(kg·d)和10g/L亚硝酸钠90mg/(kg·d),连续60d,正常对照组腹腔注射等容量的生理盐水。脑益康和脑复康均以5g/L羧甲基纤维素钠配制灌胃,连续60d。③每组随机取6只小鼠,取脑组织,采用反转录-聚合酶链反应方法检测脑组织中脑神经生长因子、脑源性神经营养因子mRNA的表达。结果:①脑益康小、中、大剂量组脑神经生长因子mRNA的表达与正常对照组比较差异无显著性(1.05±0.25,0.83±0.46,0.99±0.46,1.12±0.22,P>0.05);脑益康小、中、大剂量组脑源性神经营养因子mRNA的表达与正常对照组比较差异无显著性(0.73±0.20,0.49±0.12,0.63±0.15,0.32±0.22,P>0.05)。②模型对照组脑神经生长因子mRNA、脑源性神经营养因子mRNA显著高于正常对照组(1.98±0.60比1.12±0.22,1.32±0.37比0.32±0.22,P<0.05)。③与模型对照组脑神经生长因子mRNA和脑源性神经营养因子mRNA比较,阳性药脑复康对照组、脑益康小、中、大剂量组表达明显减少(P<0.05)。结论:脑益康提高阿尔茨海默病小鼠学习记忆作用的部分机制与其保护胆碱能神经元、改善神经生长因子、脑源性神经营养因子的逆行运输有关。

移植脑源性神经生长因子修饰骨髓间充质干细胞对帕金森病大鼠模型治疗作用的实验研究

目的:观察移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)大鼠的研究。方法 :将pEGFP(N1)-BDNF质粒进行改造与pIRESneo相连结,构建高拷贝质粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用电穿孔法转染骨髓MSCs;制备PD大鼠模型,随机分为假手术组、PD组、MSCs组、脑源性神经生长因子(brain-derivedneurotrophic factor,BDNF)组,经侧脑室移植MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓MSCs术后2、4、8周,腹腔注射阿朴吗啡诱导PD大鼠旋转行为;采用Western blot方法测定中脑黑质BDNF、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白的含量。结果:双酶切鉴定pIRESneo-EGFP-BDNF构建成功;移植术后2、4、8周MSCs组和BDNF组大鼠与PD组比较旋转次数明显减少(P<0.05),以BDNF组较MSCs比较改善更为明显(P<0.05);移植细胞干预PD模型8周后中脑黑质BDNF、TH蛋白的含量,BDNF组较MSCs组、PD组明显增高(P<0.05)。结论:经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰的骨髓MSCs能明显改善PD大鼠的行为能力,显著提高中脑黑质BDNF、TH蛋白的含量。

丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子和碱性成纤维生长因子蛋白表达影响的实验研究

目的:观察丁苯酞(NBP)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的影响。方法:72只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、AD模型组(AD组)、丁苯酞治疗组(NBP组)。采用向双侧海马区注射β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)制作AD模型。采用水迷宫实验检测AD大鼠的学习记忆能力,免疫组化法、Western blot法检测海马CA1区BDNF和bFGF蛋白表达水平。结果:与Sham组比较,AD组大鼠出现明显的学习记忆障碍,各时间点海马CA1区BDNF和bFGF蛋白表达增多(P<0.01);与AD组比较,NBP组大鼠学习记忆障碍明显改善,各时间点海马CA1区BDNF和bFGF蛋白表达明显增多(P<0.01),以4周时表达最明显。结论:丁苯酞能改善AD大鼠的学习记忆能力,其机制可能与丁苯酞上调BDNF和bFGF蛋白表达有关。

脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度选择

目的:探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下,不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响。方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料:清洁级雄性成年SD大鼠1只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R&D公司提供。②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,剪碎后胰蛋白酶消化,过滤、离心、弃上清,加入含2%B27、20μg/L表皮生长因子、20μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞,传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养,100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液,稀释后滴加于96孔板内,设立两组,全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM/F12无血清培养基100μL,半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1/2DMEM/F12无血清培养基100μL。③实验评估:观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况。对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0,50,100,150,200μg/L组,各组均加入20μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1的胎牛血清,1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。结果:①神经干细胞单克隆培养结果:单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢,半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组,随着细胞数的增多,两组细胞增殖速度也相应加快,分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球。②神经干细胞免疫细胞化学染色结果:单克隆培养后克隆球表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。③各组神经干细胞分化为神经元的比例:与0μg/L脑源性神经生长因子组比较,50,100μg/L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高(t=2.502～5.025,P<0.05);而浓度为150,200μg/L时均无明显变化(t=0.420～1.857,P>0.05)。结论:向含有B27、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子的DMEM/F12条件培养基中加入20μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1胎牛血清的情况下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50μg/L。

脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ促进神经干细胞向神经元定向分化的作用差异

目的:选用脑源性神经营养因子及胰岛素样生长因子Ⅰ作为诱导分化剂,观察其对神经干细胞定向分化的作用及其效应差异。方法:实验于2004-12/2005-10在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。以无血清培养法从孕14～17d的胚胎大鼠脑组织分离培养获得神经干细胞后,分别加入20μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L胰岛素样生长因子以及20μg/L脑源性神经营养因子+20μg/L胰岛素样生长因子诱导其定向分化。微管相关蛋白2抗体来鉴定所获得的神经元,流式细胞仪检测计数神经元的分化比例。结果:①原代培养获得了Nestin染色阳性的神经干细胞。②干细胞经诱导分化后,各组均获得了微管相关蛋白2染色阳性神经元。③脑源性神经营养因子组,胰岛素样生长因子Ⅰ组和脑源性神经营养因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组及对照组(体积分数为0.01的胎牛血清)诱导分化后,流式细胞仪计数神经元的分化比例为47.8%,57.78%,61.94%和32.69%,三个实验组与对照组差异显著(P<0.05),而胰岛素样生长因子Ⅰ组与脑源性神经营养因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组间差异无显著性(P>0.05)。结论:神经干细胞具有多向分化潜能,脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ均能促进神经干细胞向神经元定向分化,但两者无明显的协同作用。

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景：调控神经干细胞分化的微环境因素很多，数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化，如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察．于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成。材料：清洁级雄性SD大鼠3只，由中国医科大学实验动物部提供。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织，胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞，传至第4代克隆球直径约为200um时，滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM／F12进行单细胞克隆培养。传代的神经干细胞分成4组：空白对照组加入含体积分数为10％胎牛血清的DMEM／F12培养液，碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10μg／L碱性成纤维细胞生长因子、200μg／L脑源性神经营养因子、10μg／L碱性成纤维细胞生长因子＋200μg／L脑源性神经营养因子，培养1周。主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞，检测神经干细胞分化为神经元的比例。结果：单细胞克隆培养后，克隆球细胞表达巢蛋白，诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高（t=3．409-7．558，P〈0．05），且联合组升高幅度尤为显著。结论：适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用，比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用。

维甲酸联合脑源性神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法将人脐血MSCs体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA,RA组)、维甲酸联合脑源性神经生长因子(BDNF,RA+BDNF组)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,同时设对照组,对照组不加任何诱导分化剂,比较3组巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NES)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达差异。结果两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示3组诱导后均表达nestin、NSE、GFAP,BDNF+RA组的表达量多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但RA组、RA+BDNF组诱导后表达上调(P<0.05),且RA+BDNF组较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论脐血MSCs经两种神经营养因子诱导均可分化为神经样细胞,并表达神经元特异性标志物,其中添加BDNF后较单纯应用RA诱导效果好。

表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度(英文)

背景：目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点。脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元。目的：观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响。设计：对比实验。单位：中国医科大学人体解剖学教研室。材料：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养。清洁级成年SD大鼠3只,体质量200-250g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R＆D公司提供。方法：①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞。②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养。将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定。克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况。主要观察指标：神经干细胞分化为神经元的比例。结果：①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200μg/L脑源性神经生长因子组组（t=2.502-5.025,P〈0.05）;50,100μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著（P〉0.05）;对照组、150,200μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著（P〉0.05）结论：在20μg/L表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg/L。

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的：获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响。方法：实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成。①材料：清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子＋条件培养液（细胞原代培养第7天的上清液的过滤液）,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子＋脑源性神经生长因子组。空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20μg/L,脑源性神经生长因子浓度为50μg/L。③实验评估：传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定。计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低;脑源性神经生长因子组、表皮生长因子＋脑源性神经生长因子组均明显提高（t=2.309～2.779,P〈0.05）,且后者提高幅度尤为显著（t=2.309,P〈0.05）。结论：表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例。

脑源性神经生长因子促进脑梗死后小鼠内源性神经干细胞的增殖及向神经元分化

目的:探讨脑源性神经生长因子是否能促进脑梗死后小鼠内源性神经干细胞的活跃,能否刺激其分化成神经元。方法:实验于2004-07/2005-02在墨尔本大学完成。选取10周龄纯种C57BL/6J小鼠24只,分为盐水对照组、脑源性神经生长因子治疗组,每组雌雄各6只。①两组均采用结扎左侧大脑中动脉远心端法建立脑梗死模型,同时采用Matsushita描述的方法监测大脑中动脉供血区的血流量,血流量降低至少75%为有效。②脑源性神经生长因子治疗组于梗死后24h给予脑起源神经营养因子治疗,用药方式采用ALZET锇药物泵缓慢释放。将500μg/kg脑起源神经营养因子溶解于生理盐水中,加入到ALZET泵中,可在28d内持续缓慢释放药物。盐水对照组于梗死后24h给予等量生理盐水。③造模前后对两组小鼠运动功能进行Rotarod测试,记录小鼠在Rotarod上的停留时间。采用双重免疫荧光组化及共焦计数系统检测方法,对两组小鼠内源性神经干细胞的数量、密度及其分化方向进行评估。结果:①运动功能测试结果:与梗死前比较,两组小鼠在梗死后第1周均表现出明显的运动功能下降。但梗死后第2,3,4周,脑起源神经营养因子治疗组小鼠在Rotarod上的停留时间延长,运动功能的恢复明显优于盐水对照组,差异有显著性意义(P<0.01)。②组织切片双重免疫荧光染色结果:两组小鼠脑内均出现免疫荧光阳性表达的内源性神经干细胞,主要分布在病灶周围,在损伤侧的对侧也出现表达。脑起源神经营养因子治疗组的表达数量明显高于盐水对照组。③内源性神经干细胞的激活情况:梗死4周后,两组小鼠脑内都出现内源性神经干细胞的再表达,脑起源神经营养因子治疗组内源性神经干细胞数较盐水对照组明显增加,约4.2倍。同时脑起源神经营养因子治疗组分化为神经元的比例明显高于盐水对照组(36%,15%),分化为星形胶质细胞的比例低于盐水对照组(54%,77%),分化为少突胶质细胞的比例二者基本相似(10%,8%)。结论:脑起源神经营养因子可能是基于内源性神经干细胞治疗脑卒中的一种有效的方法.通过调控内源性神经干细胞的增殖分化来治疗神经系统疾病在未来将是一种新的干细胞治疗方法.

骨髓间充质干细胞尾静脉移植脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达

背景:骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤有治疗作用,但其机制尚不完全清楚。目的:应用免疫组织化学方法观察骨髓间充质干细胞静脉移植损伤脊髓局部脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达,分析骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的作用途径。方法:运用改良Allen法制备T10脊髓外伤性截瘫大鼠模型,假手术组6只,脊髓损伤组24只随机分为对照组和骨髓间充质干细胞移植组。骨髓间充质干细胞移植组、假手术组接受骨髓间充质干细胞单细胞悬液1mL(1×106cells)自大鼠尾静脉缓慢注射移植,对照组静脉注射PBS1mL。结果与结论:脊髓损伤后损伤局部的脑源性神经营养因子、神经生长因子表达增加,骨髓间充质干细胞静脉注射移植后能促进脊髓损伤局部脑源性神经营养因子、神经生长因子更进一步的表达,这可能是促进神经结构及神经功能恢复的因素之一。

脑源性神经生长因子促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的探索脑源性神经生长因子(BDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用。方法应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含β-巯基乙醇(BME)、BDNF及碱性成纤维细胞因子(bFGF)的条件培养基使培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定。结果分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs的形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论BMSCs在体外具有分化为神经元样细胞的能力,BDNF具有促进分化的作用。

神经干细胞与脑源性神经生长因子

神经干细胞对于损伤后的脑组织的修复、再生起着关键作用,脑源性神经生长因子对于干细胞的增殖分化起着重要作用。现有关于神经干细胞研究多为体外细胞研究,对于脑源性神经生长因子等因子对于内源性神经干细胞影响的研究较少。中医药诱导脑源性神经生长因子等其他因子增殖,进而影响神经干细胞增殖分化,可能成为一个新的研究切入点。

脑源性神经生长因子修饰的BMSCs向成骨细胞诱导分化的研究

骨折愈合是一个极其复杂的骨再生过程。其修复的过程就是正常胚胎骨发生过程的重演,是一系列的细胞和细胞外基质的变化过程。骨折愈合机制受到机体及局部环境的多层面、多途径的调节,在不同的愈合阶段有不同的细胞参与,

神经生长因子和脑源性神经营养因子对神经干细胞迁移的影响

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)与脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)体外实验对神经干细胞迁移的影响。方法:体外应用半固体培养法连续14d观察不同浓度的NGF、BDNF及NGF+BDNF组合诱导神经干细胞迁移的情况。结果:体外条件下不同浓度的神经营养因子的组间和组内比较显示,100μg/L BDNF诱导神经干细胞迁移作用最明显。BDNF+NGF联合组在诱导神经干细胞迁移方面未见协同效应。结论:NGF、BDNF二者皆有诱导神经干细胞迁移的作用,100μg/L BDNF组诱导迁移作用最明显。

缺氧预处理后骨髓源神经干细胞联合脑源性神经生长因子移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的研究

目的研究缺氧预处理后骨髓源性神经干细胞(source neural stem cells of bone marrow,BMSCsNSCs)联合脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)立体定向移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的疗效,为高原地区脑梗死的细胞移植治疗提供动物实验基础。方法 72只SD大鼠随机分为缺氧预处理组和常氧组,每组各36只,缺氧预处理组造模前3 d进行低氧预处理(hypoxic preconditioning,HPC)。两组均制作大脑中动脉阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。每组分为3个亚组(BMSCsNSCs+BDNF组、BMSCsNSCs组和对照组,每组各12只),分别梗死灶同侧尾状核内立体定向移植BMSCsNSCs+BDNF、BMSCsNSCs和DMEM/F12培养基。移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d进行神经功能缺损评分,每个时间点每组取2只大鼠,断头取脑后行免疫组织化学染色,观察5-溴脱氧尿嘧啶(5-Bromodeoxyuridine,Brdu)阳性细胞的迁移路径,行CD133、Nestin、微管相关蛋白2(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)、兔抗微管蛋白(β-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、半乳糖神经酰胺(Galactosylceramidase,Galc)免疫荧光染色,了解骨髓源性神经球分化情况。结果常氧BMSCsNSCs+BDNF组、常氧BMSCsNSCs组、缺氧预处理BMSCsNSCs+BDNF组、缺氧预处理BMSCsNSCs组7 d、14 d、21 d、28 d和35 d的神经功能评分均显著低于同组3 d时的神经功能评分。移植3 d时缺氧预处理对照组神经功能学评分显著低于常氧对照组(P=0.040);移植7 d时缺氧预处理BMSCsNSCs+BDNF组神经功能评分显著低于常氧BMSCsNSCs+BDNF组(P=0.031)。无论缺氧预处理组还是常氧组,BMSCsNSCs+BDNF组CD133、Nestin、MAP-2、β-tubullin、GFAP、Galc免疫荧光染色光密度值(integral optical density,IOD)均显著高于BMSCsNSCs组(均P<0.001);BMSCsNSCs+BDNF组、BMSCsNSCs移植组各检测指标IOD均高于对照组(均P<0.001)。结论大鼠缺氧预处理后BMSCsNSCs联合BDNF立体定向移植可显著提高BMSCsNSCs的效果。缺氧预处理并不能促进外源性BMSCsNSCs分化,但却能明显改善大鼠神经功能。

脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力

背景:研究发现多种干细胞治疗老年痴呆大鼠效果显著,但关于脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)修饰人羊膜间充质干细胞移植治疗老年痴呆的研究报道较少。目的:探讨BDNF修饰人羊膜间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响。方法:将48只SD大鼠根据随机数字法分为对照组、模型组、干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组,每组12只。后3组建立老年痴呆大鼠模型,干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组大鼠基底前脑注射人羊膜间充质干细胞和BDNF修饰人羊膜间充质干细胞。移植后2周,大鼠在三等份辐射式迷宫箱中检测学习记忆能力,免疫组化染色结合图像分析测定p75 NGFR阳性神经元数目。结果与结论:(1)模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均低于对照组(P<0.05),干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均高于模型组(P<0.05),BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数高于干细胞移植组(P<0.05);(2)模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均低于对照组(P<0.05),干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均高于模型组(P<0.05),BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力高于干细胞移植组(P<0.05);(3)BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习次数与p75 NGFR阳性神经元数呈负相关(P<0.05),记忆能力与p75 NGFR阳性神经元数呈正相关(P<0.05);(4)结果表明,人羊膜间充质干细胞移植可提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力,BDNF修饰人羊膜间充质干细胞可进一步提高人羊膜间充质干细胞的治疗效果。

人脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植对痴呆大鼠学习记忆的改善

目的 观察神经干细胞( neural stem cell,NSC)和人脑源性神经营养因子( human brain derivedneurotrophic factor,h BDNF)基因修饰NSC移植对阿尔茨海默病( Alzheimer disease,AD)模型鼠的学习记忆改善作用。 方法 SD大鼠4 0只随机分为4组,每组10只。 组为正常对照组;其余3组进行单侧切断大鼠穹窿海马伞( fibria-fornix,FF)制备AD模型, 组为损伤组; 、组于术后10～12 d,侧脑室移植h BDNF基因修饰及未修饰的NSC分别为NSC组和BDNF组。移植后2周进行Morris水迷宫定位航行及空间探索行为学检测。 结果 组和 组的平均逃避潜伏期为4 1.84±2 1.76 s和2 5 .2 3±17.0 6 s,较 组潜伏期70 .91±2 3.6 7s明显缩短,差异有统计学意义( P<0 .0 1) ;平台象限游泳距离占总游泳距离的百分比: 组和 组分别为36 .9%和4 2 .0 % ,较 组2 6 .0 %明显增高,差异有统计学意义( P<0 .0 1) ; 组大鼠采取边缘式和随机式搜索模式显著多于其它各组,差异有统计学意义( P<0 .0 1)。其中 组大鼠的平均逃避潜伏期和平台象限游泳距离百分比及搜索策略接近 组( P>0 .0 5 ) ,采取直线式和趋向式的搜索策略显著多于其它各组( P<0 .0 1)。 结论 NSC和h BDNF基因修饰NSC移植对AD模型鼠的行为学有不同程度的改善,h BDNF基因修饰NSC移植较?