细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中caspase-3的活化

目的探讨细菌氧化还原蛋白azurin诱导人骨肉瘤细胞U2OS凋亡过程中是否有caspase-3的活化。方法Annexin-V/PIFCM检测细胞凋亡情况,用Westernblot分析caspase-3酶原的变化,半定量RT-PCR检测caspase-3mRNA水平的改变,比色法测定caspase-3的相对活性。结果用0、25、50、100、200mg/Lazurin处理U2OS细胞24h,随药物浓度的增加,caspase-3酶原的蛋白水平减少,caspase-3的mRNA水平增加(P<001)。用100mg/Lazurin分别处理细胞3、6、12、24、48h,caspase-3活性于6h开始升高,24h达高峰(为对照组的72倍,P<001),48h仍高于对照组(P<001);用不同浓度的azurin处理细胞,caspase-3活性呈浓度依赖性升高。结论Azurin诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡过程中有caspase-3的活化,caspase-3在azurin诱导的骨肉瘤细胞凋亡机制中发挥了重要的作用。

Fas抗原和caspase-8调控细菌氧化还原蛋白azurin诱导的人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨Fas抗原和caspase-8在细菌氧化还原蛋白azurin诱导人骨肉瘤细胞凋亡中的调控机制及作用。方法:用150mg/L浓度的azurin处理U2OS细胞,分别作用6、12、24和48h。细胞免疫化学法检测Fas抗原的表达。用荧光试剂盒检测caspase-8的活性。流式细胞仪检测azurin和抗-Fas-抗体诱导的骨肉瘤细胞凋亡百分率,以及加入caspase-8活性抑制剂IETD-FMK后凋亡百分率的变化。结果:Azurin诱导U2OS细胞凋亡后,与对照组比较,Fas抗原表达强度增加(P<0.01),caspase-8活性升高(P<0.01)。Fas抗原表达和caspase-8活性随着azurin作用时间的延长而逐渐升高,至24h后达到高峰,然后缓慢下降,但仍显著高于对照组(P<0.01)。Fas抗原的表达与caspase-8活性变化呈显著正相关(r=0.873,P<0.01)。表达增强的Fas抗原具有转导凋亡信号的功能,抗-Fas抗体借此增强azurin诱导U2OS细胞凋亡的作用。Caspase-8活性抑制剂IETD-FMK能阻断caspase-8活化而抑制azurin或抗-Fas抗体诱导的U2OS细胞凋亡,与抑制剂组比较,细胞凋亡百分率显著差异(P<0.01)。结论:Fas依赖途径可能为细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡主要机制之一,caspase-8活性上调可能在凋亡过程中发挥重要作用。