埃希菌全细胞转化阿糖尿苷合成阿糖腺苷

利用选择培养基从土壤中筛选到具有高核苷磷酸化酶活性的AEM0812菌株,通过16Sr DNA鉴定,初步确定为埃希菌(Escherichia sp.)。该菌株的最适生长温度与产酶温度均为37℃,最适产酶pH为7.5～8.0,通气培养最佳产酶的发酵时间为8～9h。利用该菌全细胞建立了以阿糖尿苷为底物酶促合成阿糖腺苷的反应体系,成功得到阿糖腺苷。优化反应条件,并进行了100L放大试验,结果阿糖尿苷转化率为78.17%,反应液中阿糖腺苷浓度为9.38g/L。

大剂量阿糖胞苷治疗时血浆阿糖胞苷及阿糖尿苷的HPLC测定方法

目的建立HPLC法测定大剂量阿糖胞苷治疗时血浆中阿糖胞苷(Ara-C)和阿糖尿苷(Ara-U)的浓度。方法反相高效液相色谱法,色谱柱:Phenomenex Fusion(4.6×150mm,4μm),流动相:0.01M磷酸盐缓冲液(pH=7.2)柱温:30℃,流速:0.8mL.min-1,检测波长:Ara-C:280nm,Ara-U:262nm。结果 Ara-C血药浓度在0.5～20μg.mL-1范围内线性良好(R=0.99),回收率为96.1～105.3%,Ara-U血药浓度在1～40μg.mL-1范围内线性良好(R=0.99),回收率为97.2～104.7%,日间、日内RSD小于5%和10%。结论本方法简便、快速,适合用于临床血药浓度监测和药动学研究。

HPLC法测定血浆中阿糖胞苷及阿糖尿苷浓度

目的：建立同时测定血浆中阿糖胞苷和阿糖尿苷浓度的高效液相色谱法，并用于1例急性非淋巴细胞白血病患儿的血药浓度监测。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱：XTerra C18（4．6mm×250mm，5μm）；流动相：0．01mol·L^-1的磷酸盐缓冲液（pH=6．0）；检测波长：280nm；流速：0．95mL·min^-1；柱温：30℃。结果：阿糖胞苷血药浓度在0．25～21．74mg·L^-1范围内线性关系良好（r=0．9996），检测限为0．1mg·L^-1，日内、日间RSD小于5．0％和8．0％；阿糖尿苷血药浓度在0．99～86．96mg·L^-1范围内线性关系良好（r=0．9993），检测限为0．4mg·L^-1，日内、日间RSD小于5．0％和8．0％。阿糖胞苷及阿糖尿苷平均提取回收率高于96．0％：结论：本方法简单、快速、准确。适用于临床上阿糖胞苷和阿糖尿苷的血药浓度监测及药动学研究．

液质联用技术在大鼠血浆阿糖胞苷和代谢产物阿糖尿苷定量分析中的应用

建立同时测定阿糖胞苷和代谢产物阿糖尿苷在大鼠血浆中浓度的LC-MS/MS方法,并将该方法用于研究阿糖胞苷静脉注射后血药浓度的监测。色谱柱是安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.8μm),采用梯度洗脱的方式分离被测物质,利用沉淀蛋白的方法处理血浆样品,以多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描方式检测。阿糖胞苷和阿糖尿苷在线性范围内线性关系良好,日内日间精密度(RSD)均小于15%,准确度(RE)在±15%以内,平均提取回收率都在80%以上,基质效应在90%和110%之间。该方法适用于阿糖胞苷注射后的临床前药物监测和大鼠药物动力学研究。

固定化细胞转化阿糖尿苷合成阿糖腺苷

采用聚乙烯醇、卡拉胶和聚丙烯酰胺为混合载体固定化埃希菌AEM0812细胞。以8.0%聚乙烯醇、1.0%卡拉胶和10%聚丙烯酰胺作为载体,菌体浓度为30%,在pH 7.0、含4.0%氯化钾的饱和硼酸溶液(成型剂)中处理36 h,得相对酶活力为98.17%且较稳定的颗粒型固定化细胞,用来催化转化阿糖尿苷合成阿糖腺苷,在54℃、pH 6.5和缓冲液离子浓度120 mmol/L的最适条件下,阿糖尿苷的转化率为68%。固定化细胞连续5次反应的平均转化率约54.3%。

RP-HPLC法测定小鼠各组织中阿糖胞苷及阿糖尿苷浓度

目的:建立在血浆、脑脊液和睾丸组织中同时测定阿糖胞苷及其代谢物阿糖尿苷浓度的反相高效液相色谱法并进行小鼠体检内测定波量长分为析28。0 n方m法,柱:色温谱为柱30为℃X,T进er样ra量C18为,流10动μ相L。为将0.0115 m只o小l.鼠L-随1磷机酸分盐成缓A冲、B液、(Cp H3组=,6分.0)别-乙腹腈腔=注9射5∶阿5,糖流胞速苷为105.09、51 m 0L0.0m、2in 0-010,mg·kg-1,30 min后测定小鼠血浆、脑脊液、睾丸组织中的阿糖胞苷及阿糖尿苷浓度。结果:阿糖胞苷、阿糖尿苷检测浓度线性范围分别为0.25～21.74、0.99～86.96 mg·L-(1r>0.998 8),检测限为0.1～0.4 mg·L-1;平均回收率均≥96%,RSD≤7.19%。阿糖胞苷及阿糖尿苷在小鼠血浆、脑脊液和睾丸组织中的药物浓度有显著性差异,低、中剂量给药组只在血浆中检测出阿糖尿苷。结论:所建立的测定方法简单、快速、准确、重复性好,可为临床上阿糖胞苷和阿糖尿苷血药浓度的监测和药动学研究提供参考。

阿糖胞苷在大鼠体内转化为阿糖尿苷的药动学研究

目的建立测定大鼠血浆中阿糖尿苷的LC-MS/MS方法,用于大鼠尾iv注射用盐酸阿糖胞苷后阿糖尿苷在体内的药动学研究。方法采用LC-MS/MS法。ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相：水–乙腈,梯度洗脱;体积流量：0.2 mL/min;柱温：40℃;进样量：5μL。离子源：ESI源;扫描方式：多反应监测（MRM）方式,扫描时间为0.1 s;毛细管电压：2.5 kV;锥孔电压：26 V;离子源温度：110℃;去溶剂气温度：350℃;去溶剂气流量：500 L/h;锥孔气流量：50 L/h。采用回归方程计算血浆中阿糖尿苷。SD大鼠尾iv注射用盐酸阿糖胞苷,制备血药质量浓度–时间曲线,计算药动学参数。结果阿糖尿苷在1.0~1 000 ng/mL线性关系良好,日内、日间RSD值均小于15%,准确度在±15%,平均提取回收率在90%以上,基质效应在97.3%,稳定性良好。药动学参数：tmax是1.0 h,Cmax是134.2 ng/mL,AUC0-t是2 316.0 ng·h/mL,t1/2是4.3 h。结论该方法适合大鼠尾iv阿糖胞苷后阿糖尿苷在体内的药动学研究。

高效液相色谱法同时测定人全血中阿糖胞苷及其代谢物阿糖尿苷的浓度

目的建立同时测定人全血中阿糖胞苷及其代谢产物阿糖尿苷的高效液相色谱法。方法用蛋白沉淀法处理全血样品。色谱柱:Cosmosil Cholester(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:甲醇-0.01 mol·L^(-1)磷酸盐缓冲液=3∶97,柱温:25℃,流速:1.0 m L·min^(-1),检测波长:280 nm。结果标准曲线方程:阿糖胞苷为y=16417.59x-14511.01(r=0.998 5),在1.55~198.00μg·m L^(-1)线性关系良好;阿糖尿苷为y=4468.72x-1521.15(r=0.997 8),在1.34~171.00μg·m L^(-1)线性关系良好。阿糖胞苷的最低检测浓度为0.47μg·m L^(-1),提取回收率74.84%~87.74%;阿糖尿苷最低检测限为0.40μg·m L^(-1),回收率77.76%~88.92%,日内精密度RSD均≤15%,高、中浓度点日间RSD均≤15%,低浓度日间RSD<20%。结论本方法快速、准确、灵敏,可用于测定人全血中阿糖胞苷及其代谢产物阿糖尿苷的浓度。

阿糖尿苷探针同步荧光法快速测定生物样品中的蛋白含量

通过研究阿糖尿苷与人血清白蛋白(HSA)体系的三维荧光光谱,证明两者可以发生相互作用,并导致HSA的微环境和构象发生变化。考查了Δλ、加入顺序、离子强度等因素对该体系同步荧光强度的影响,选取阿糖尿苷测定生物样品中蛋白含量的最佳实验条件。体系的同步荧光强度与HSA的浓度在0.04～4.0×10-6mol/L范围内呈良好的线性关系,此法的检测限可达0.75 mg/L,线性相关系数为0.9990。在此基础上,以阿糖尿苷为分子探针,测定了人血清、唾液和尿样中的蛋白质含量,回收率在97.3%～104.5%之间。

阿糖胞苷及其代谢物在血液中的HPLC测定方法

采用ＨＰＬＣ测定血液中阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）及其代谢产物阿糖尿苷（Ａｒａ－Ｕ）的含量，固定相为Ｖｔｒａｓｐｈｅｒｅ－ＯＤＳ５μｍ，流动相为１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ５．６０）。Ａｒａ－Ｃ平均回收率９８．１０％±３．３％，ＲＳＤ＝３．４２，线性范围０．５～２０μｇ／ｍｌ；Ａｒａ－Ｕ平均回收率９７．２０％±４．１０％，ＲＳＤ％＝４．２２，线性范围２～４０μｇ／ｍｌ。在样品测定时，加入６５％三氯乙酸以抑制阿糖胞苷的降解，效果满意。

HL-60细胞内阿糖胞苷活性成分动态观察

目的探索与研究建立白血病细胞内阿糖胞苷(Ara-C)活性成分及其代谢产物阿糖尿苷(Ara-U)水平测定方法,并观察白血病细胞内上述Ara-C活性相关物质的变化规律与差异。方法采用白血病细胞株(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R),在Ara-C作用下长期传代。对5、10、20、30、40、50代细胞,分别采用放射免疫法(RIA)和高效液相色谱法(HPLC)动态观察和比较两种细胞内的Ara-C活性成分,即三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)、与DNA嵌合的Ara-C以及Ara-U的水平。结果 HL-60细胞内Ara-CTP、与DNA嵌合的Ara-C在传至20代后,均呈现持续下降;在细胞传代初期至第40代,各阶段HL-60细胞内Ara-CTP水平均显著高于HL-60/R;在传代初期至第20代过程中,HL-60和HL-60/R细胞内的与DNA嵌合的Ara-C并无显著差异。经长期传代之后,HL-60细胞内的Ara-U呈持续上升,且均显著高于相同传代阶段的HL-60/R。结论白血病细胞在Ara-C的长期作用下,Ara-CTP、与DNA嵌合的Ara-C水平,在不同时段出现明显下降趋势,可能是导致白血病患者发生对Ara-C耐药的主要原因。

酶法合成抗病毒药物阿糖腺苷

目的:为了开发一种生产阿糖腺苷的有效方法。方法:研究了以产气肠杆菌完整细胞为催化剂酶法合成阿糖腺苷,优化了菌体培养条件以及酶反应条件。结果:在培养基中添加0.5%葡萄糖,33℃下培养16h,既能得到较多菌体,又能使菌体的催化活性保持较高。酶反应在pH7.0、25mmol/L的磷酸钾缓冲液中进行,底物浓度为阿糖尿苷30mmol/L,腺嘌呤10mmol/L,加入10%湿菌体,在60℃下振荡反应48h,腺嘌呤转化率可达90%。结论:酶法合成阿糖腺苷可应用于大规模工业化生产。

埃希菌催化合成阿糖鸟苷中间体阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷

利用埃希菌(Escherichia sp.)AEM0812细胞催化阿糖尿苷和2,6-二氨基嘌呤合成阿糖鸟苷中间体阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷。通过优化反应条件,得到最适酶促反应条件为:在60 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中加入15%埃希菌AEM0812细胞及60 mmol/L阿糖尿苷和60 mmol/L 2,6-二氨基嘌呤,60℃反应48 h。在上述条件下,阿糖尿苷的转化率可达95.2%。

两种抗乙肝病毒的新药

随着病毒分子生物学研究的不断进展,已知乙肝病毒(HBV)复制分为转录期、逆转录期及DNA复制期3个阶段。因此,阻断病毒复制环节中不同靶点是开发新的抗HBV药物的方向。抗病毒作用靶点的重点在于抑制病毒复制酶。

UPLC法同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质

目的：建立同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质的方法。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为Inertsil ODS-3 C18流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇（梯度洗脱），流速为0．8ml／min，检测波长为254nm，柱温为40℃，进样量为10μl。结果：尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、盐酸阿糖胞苷检测质量浓度分别在0．1008～20．16、0．1～20．12、0．0956～19．12、0.1～20．004μg／ml范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r=0．9999、0．9998、0．9999、0.9999）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤0．79％；尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷平均加样回收率为103．8％、102．2％、99．7％，RSD分别为2．44％、2．69％、3．16％（n=9）。结论：该方法准确、灵敏度高、专属性强、重复性好．可用于盐酸阿糖胞苷原料药的质量控制。