扁蒴藤素调节 Hippo/YAP 信号通路对骨肉瘤细胞阿霉素耐药性的影响

目的探讨扁蒴藤素(PM)对骨肉瘤细胞阿霉素(ADM)耐药性的影响及其作用机制。方法采用ADM浓度梯度递增长期培养法在体外建立ADM耐药细胞MG-63/ADR,CCK-8检测不同浓度ADM对骨肉瘤细胞MG-63和MG-63/ADR细胞活力的影响,验证ADM耐药性;随后将MG-63/ADR细胞随机分为MG-63/ADR组(正常培养)、PM低剂量组(加入0.5µmol/L PM)、PM中剂量组(加入1.0µmol/L PM)、PM高剂量组(加入2.0µmol/L PM),CCK-8检测不同浓度ADM处理下各组细胞活力;平板克隆形成实验检测各组细胞对ADM的敏感性;显微镜下观察细胞形态;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测磷酸化哺乳动物STE20样蛋白激酶1(p-MST1)、MST1、磷酸化大肿瘤抑制因子1(p-LATS1)、LATS1、磷酸化Yes相关蛋白(p-YAP)、YAP蛋白表达。结果25、125、625、3125、15625 ng/mL ADM干预下,MG-63/ADR细胞活力较MG-63细胞显著升高(P<0.05),说明ADM耐药细胞模型建立成功。与MG-63/ADR组相比,PM低、中、高剂量组细胞数量减少且细胞逐渐皱缩、间距变大,细胞活力、细胞克隆形成率以及p-YAP/YAP水平下降(P<0.05),细胞凋亡率和p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1水平显著提高(P<0.05)。结论PM对骨肉瘤细胞ADM耐药性具有抑制作用,其可能与激活Hippo通路、下调YAP信号有关。

miR-424靶向MEK1对白血病HL-60细胞系增殖、凋亡及阿霉素耐药性的影响

目的探究miR-424对白血病HL-60细胞增殖、凋亡及阿霉素(ADM)耐药性的影响及其可能的作用机制。方法体外培养正常人的外周血单核细胞(PBMC)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60),向细胞HL-60转染miR-424阴性对照、miR-424 mimic,将细胞分为空白对照组、NC组和miR-424 mimic组,以PBMC为正常对照组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PBMC及各组HL-60细胞中miR-424、丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)mRNA相对表达水平。CCK8法检测各组HL-60细胞增殖情况。流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡情况。对各组HL-60细胞进行ADM处理,CCK8法检测各组HL-60细胞对ADM敏感性,双荧光素酶报告基因检测miR-424与MEK1的靶向关系,蛋白印迹法(WB)检测各组HL-60细胞MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白相对表达水平。结果与正常对照组相比,空白对照组HL-60细胞中miR-424相对表达水平显著降低,MEK1 mRNA相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与空白对照组、NC组相比,miR-424 mimic组HL-60细胞增殖率、ADM IC50、MEK1 mRNA、Ki67、Bcl-2、MEK1蛋白相对表达水平显著降低,miR-424、细胞凋亡率、Bax蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-424 mimic+WT-MEK13'-UTR组的荧光素酶相对活性低于miR-424 NC+WT-MEK13'-UTR组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-424在白血病HL-60细胞中低表达,miR-424过表达可能通过靶向抑制MEK1表达,抑制白血病HL-60细胞增殖、促进凋亡,提高细胞对阿霉素的敏感性。

RNA干扰乳腺癌耐药蛋白基因表达改变乳腺癌耐药细胞耐药性的研究

目的利用RNA干扰技术抑制乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR乳腺癌耐药蛋白（BCRP）基因的表达并提高对阿霉素（ADR）的敏感性。方法针对BCRP的mRNA序列，设计两条RNA干扰链（BCRP-A和BCRP-B），构建出小干扰RNA（siRNA）表达载体pG—BCRP—AsiRNA-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和pG—BCRP-BsiRNA—EGFP。实验分为4组：A、B、C3组分别转染BCRP-A、BCRP-B、HK-siRNA（对照组）；D组转染过程中未加入任何质粒（空白组）。通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测siRNA阻断BCRP基因表达的效率，应用噻唑蓝（MTT）法分析siRNA干扰后MCF-7／ADR的耐药性变化。结果RT—PCR和Westernblot法检测结果表明BCRP—A和BCRP-B两条干扰链干扰效率不一，前者较后者对BCRPmRNA和蛋白质表达抑制率均明显优于后（P〈0．05）；MTr法分析结果说明BCRP-A组对ADR的药物敏感性明显提高，其IC50为（184．6±25．3）ng／ml，与BCRP—B干扰组和对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论RNA干扰技术可用于抑制BCRP基因的表达，并提高对ADR的敏感性，但不同干扰链的干扰效率差异较大。

基于超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用的白血病细胞及耐药细胞非靶标代谢组学研究

建立了一种基于超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(UPLC-IT-TOF MS)联用的非靶标代谢组学方法,研究了人慢性髓系白血病细胞及其阿霉素耐药细胞(K562和K562-ADM)之间的代谢物差异。考察了细胞破碎方法、提取溶剂体系和溶剂体积对细胞代谢物提取效果的影响,实验发现采用超声破碎法,以800μL的80%甲醇提取时可得到较多的代谢特征峰,方法重复性和稳定性较高。将建立的方法应用于K562及K562-ADM细胞的代谢组差异研究,对所得数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。结果显示2种细胞的代谢特征存在显著差异,并发现40个对分类有显著贡献的代谢物,差异代谢物主要参与氨基酸代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢等通路。该方法可用于K562和K562-ADM细胞的代谢组差异研究,可望为白血病细胞耐药性的代谢组学研究提供帮助。

Reversal of Multidrug Resistance by Neferine in Adriamycin Resistant Human Breast Cancer Cell Line MCF-7/ADM

Objective: To study the reversal effect of neferine on adriamycin (ADM) resistant human breast cancer cell line MCF-7/ADM. Methods: The cytotoxic effect of Nef or ADM was determined by 3-[4, 5-dimethylthiazol-2.-yl], 5-diphenyl tetraxolium bromid (MTT) assay. Apoptosis and the expression of P-glycoprotein (P-gp) were detected by flow cytometry (FCM). The intracellular ADM concentration was measured by HPLC. Results: Nef at 1, 5, 10 mol/L decreased the IC50 of ADM to MCF-7/ADM from 11.63 g/mL to 4.59, 2.44, 0.27 g/mL respectively. MCF-7/ADM could resist the apoptosis induced by ADM while Nef (1-10 mol/L) could augment ADR-mediated apoptosis. Nef (10 mol/L) increased the accumulation of ADM up to 2.88 fold in MCF-7/ADM but not in sensitive cells MCF-7/S and reduced the expression of P-gp in MCF-7/ADM cells. Conclusion: Nef can circumvent multidrug resistance (MDR) of MCF-7/ADM cells and the mechanism was associated with the increase of intracellular accumulation of ADM and the reduced expression of P-gp in MCF-7/ADM cells.