盐酸阿霉素-黄芪甲苷脂质体制备工艺研究

目的优选盐酸阿霉素-黄芪甲苷脂质体(LPs-DOX/AS)的制备工艺条件。方法通过单因素试验考察了脂质体制备方法、游离药物去除方式、孵育温度对脂质体制备的影响;以盐酸阿霉素、黄芪甲苷的包封率与载药量为考察指标,采用L9(34)正交试验,考察了磷脂浓度、磷脂与胆固醇的比例、药脂比对LPs-DOX/AS制备工艺的影响,并对所制得脂质体的粒径大小、微观形态和药物包封率及载药量等进行表征。结果 LPs-DOX/AS最佳制备工艺条件:磷脂浓度为8 mg/mL,磷脂与胆固醇比为10∶1,药脂比为1∶5。所制备的脂质体粒径为(102.6±0.2)nm,大小分散均匀;盐酸阿霉素的包封率和载药量分别为(98.57±0.49)%、(4.62±0.02)%,黄芪甲苷的包封率和载药量分别为(99.37±0.08)%、(14.45±0.04)%。结论优选工艺所制备的LPs-DOX/AS包封率和载药量较高,大小分散均匀,为LPs-DOX/AS的进一步研究奠定了基础。

黄芪甲苷对阿霉素诱导的HL-1细胞凋亡的抑制作用及机制研究

目的探讨黄芪甲苷(astragaloside IV,ASIV)对阿霉素诱导HL-1细胞凋亡的影响及机制,为进一步研发治疗阿霉素诱导心肌损伤的新药提供可靠的实验依据。方法将HL-1心肌细胞分为正常对照组(Control组)、模型组(Model组)、1μmol/L ASIV、2μmol/L ASIV及4μmol/L ASIV组等5组。用5.2μmol/L的DOX溶液放入细胞培养箱中培养12 h制备心肌细胞损伤模型后,以1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的ASIV溶液加入细胞损伤模型中,再放入细胞培养箱中培养12 h。CCK8法确定阿霉素造模药物浓度,流式细胞术确定浓度阿霉素造模时间,荧光染色法检测不同浓度ASIV对阿霉素诱导的HL-1心肌细胞凋亡、线粒体膜电位水平及ROS水平;分光光度检测法检测ASIV对阿霉素诱导的HL-1心肌细胞上清NO含量。结果5.2μmol/L的DOX培养12 h诱导HL-1心肌细胞凋亡模型。与Model组相比,2μmol/L和4μmol/L ASIV组细胞凋亡明显减少(P<0.01),NO含量显著增加(P<0.01);ASIV各剂量组Annexin V-FITC表达均有降低趋势(P<0.01)、ASIV 1μmol/L、ASIV 2μmol/L Mito-Tracker Red CMXRos表达均明显升高(P<0.05),ASIV 4μmol/L Mito-Tracker Red CMXRos表达均明显升高(P<0.01),ASIV 1μmol/L、ASIV 2μmol/L和ASIV 4μmol/L组ROS表达显著降低(P<0.05)。结论ASIV可通过减轻心肌细胞膜电位下降,降低ROS表达,提高NO含量,减轻氧化应激损伤,从而抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡,且呈剂量依赖性。

γ-环糊精-金属有机骨架负载黄芪甲苷的制备及其性质研究

目的 以γ-环糊精-金属有机骨架(CD-MOF)为载体制备载黄芪甲苷(AST)的AST@CD-MOF并研究其对AST溶解度、溶出速率、稳定性及A549细胞凋亡的影响。方法 以溶剂孵育法将AST负载于CD-MOF中,采用环境扫描电子显微镜、氮气吸附脱附等手段表征AST@CD-MOF的形貌和吸附特性,同时对AST@CD-MOF的溶解度、溶出速率、稳定性及诱导A549细胞凋亡能力进行考察,并与环糊精包合物(AST@γ-CD)和原料药进行对比。结果 制备得到的AST@CD-MOF形貌呈均一的立方晶体,粒径约为140 nm,优化后的AST@CD-MOF载药量为(32.29±2.57)%,且具有良好的稳定性;AST@CD-MOF中AST的溶出速率和累计溶出百分率均得到显著提升,在6 h内的累计释放率达到80%以上;AST@CD-MOF诱导细胞的总凋亡比率可达68.18%,显著高于游离AST和AST@γ-CD。结论 CD-MOF显著提高了AST的水溶性和溶出速率,增强了AST诱导A549细胞凋亡的能力。

黄芪甲苷通过调控Sirt1/PGC-1α信号通路发挥对阿霉素肾病的保护作用

目的研究黄芪甲苷通过调控沉默信息调节因子2同源蛋白1(Sirt1)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1α)信号通路发挥对阿霉素肾病的保护作用。方法60只6周的雄性SD大鼠中取8只作正常对照组,其余大鼠尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型,采用随机数字法将筛选出的40只模型大鼠分为模型组、西药组、黄芪甲苷低、中、高剂量组,各8只。西药组以每日0.9 mg/kg标准洛丁新混悬液灌胃,黄芪甲苷低、中、高剂量组每日分别以20、40、80 mg/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组给予等容积的0.9%氯化钠溶液。干预后采用生化法检测各组24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐、尿素氮水平,酶联免疫吸附法检测肾组织白细胞介素1β(IL-1β)含量;采用苏木精-伊红染色法观察大鼠肾脏病理形态。蛋白印迹法检测肾组织中Sirt1、PGC-1α蛋白表达。结果相对于正常组,模型组24 h尿蛋白、肾组织IL-1β水平显著上升,差异均有统计意义(P<0.05);相对于模型组,西药组与黄芪甲苷高剂量组24 h尿蛋白显著下降,黄芪甲苷高剂量组IL-1β水平明显降低,差异均有统计意义(P<0.05);相对于西药组,黄芪甲苷低、中剂量组24 h尿蛋白、IL-1β上升,差异均有统计意义(P<0.05);相对于低剂量组,黄芪甲苷高剂量组24 h尿蛋白、IL-1β显著下降,差异均有统计意义(P<0.05)。相对于正常组,模型组白蛋白水平下降,ALT、肌酐、尿素氮水平上升,差异均有统计意义(P<0.05);与模型组比较,西药组与黄芪甲苷中、高剂量组白蛋白、ALT水平有所改善,且肌酐、尿素氮水平下降,差异均有统计意义(P<0.05)。西药组与黄芪甲苷高剂量组的各指标相当,优于黄芪甲苷低、中剂量组,差异均有统计意义(P<0.05)。正常组肾小球结构正常,无病理变化;模型组肾脏系膜有增生,系膜基质增多,肾小管上皮有肿胀,可见大量炎症细胞浸润;西药组与黄芪甲苷中、高剂量组肾小球系膜细胞增生有不同程度减轻,肾小管上皮细胞水肿得到改善,炎症细胞浸润缓解,效果优于黄芪甲苷低剂量组。与正常组比较,模型组Sirt1、PGC-1α蛋白表达升高,差异均有统计意义(P<0.05);与模型组比较,西药组Sirt1、PGC-1α蛋白抑制表达,差异均有统计意义(P<0.05);黄芪甲苷高剂量组Sirt1、PGC-1α蛋白表达高于低、中剂量组,差异均有统计意义(P<0.05)。结论黄芪甲苷能改善阿霉素诱导的大鼠肾损伤,通过上调肾组织Sirt1、PGC-1α蛋白表达以抑制炎症反应,改善肾功能而延缓病情发展,其中80 mg/kg剂量的效果更佳。

黄芪甲苷在N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的神经元兴奋性损伤中的保护作用

目的探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ)对N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)介导的神经元兴奋性损伤的保护作用。方法选择新生0~1 d的C57/BL6J小鼠,分离海马区神经元进行原代细胞培养,将培养的神经元随机分为对照组、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)损伤模型组、氧-糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型组、NMDAR抑制剂氯胺酮组及黄芪甲苷组。采用Hoechst-33342染色观察各组神经元死亡情况,采用ELISA法检测各组神经元乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况;采用Ca^(2+)成像观察不同条件下〔加入NMDA;NMDAR抑制剂APV(100μmol/L)预处理+NMDA;黄芪甲苷(100μmol/L)预处理+NMDA;无Ca^(2+)+NMDA〕神经元内钙离子浓度;采用Western blot测定各组神经元活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的表达。另选择出生后4~6周的C57BL/6雄性小鼠,制备包含海马的冠状脑切片,使用电压钳观察黄芪甲苷应用前后突触后膜电流的变化。结果与应用黄芪甲苷(100μmol/L)前比较,应用黄芪甲苷(100μmol/L)后海马CA1区锥体细胞微小兴奋性突触后电流的平均峰值降低〔(9.96±0.43)pA比(12.63±0.45)pA;t=3.741,P<0.05〕,平均频率〔(0.52±0.03)Hz比(0.68±0.05)Hz;t=2.933,P<0.05〕下降;与NMDA损伤模型组相比,黄芪甲苷组神经元凋亡率降低,LDH释放减少,活化型Caspase-3表达减低,细胞内钙离子内流减轻(均P<0.05);在体外OGD模型实验中,黄芪甲苷亦表现出同样的神经元保护作用。结论黄芪甲苷在NMDAR介导的神经元兴奋性损伤中具有保护作用,其作用机制与抑制NMDAR有关。

黄芪甲苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠神经的影响及作用机制

目的探讨黄芪甲苷(astragalolosideⅣ,AS-Ⅳ)对脑缺血-再灌注(cerebral ischemia-reperfusion injury,CI-RI)大鼠脑损伤的影响及可能的作用机制。方法选取65只大鼠采用大脑中动脉阻塞线栓法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立CI-RI模型,将造模成功大鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组,另设对照组,各12只。AS-Ⅳ低剂量组、AS-Ⅳ中剂量组和AS-Ⅳ高剂量组分别灌胃20、40、80 mg·kg^(-1) AS-Ⅳ混悬液(蒸馏水配制),对照组及模型组给予等量蒸馏水。评价大鼠神经功能缺损情况;用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)水平;HE染色观察各组大鼠脑组织病理变化;用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白印迹法(Western blotting)分别检测大鼠脑组织中过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator receptorγcoactivator,PGC-1α)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)mRNA和蛋白的表达情况。结果与模型组比较,AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠各时间神经功能学Garcia JH评分、GSH-Px、SOD、PGC-1α、Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均升高,TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比较,AS-Ⅳ中剂量、AS-Ⅳ高剂量组诸项指数水平的改变更明显,且AS-Ⅳ高剂量组的变化更显著(P<0.05)。结论AS-Ⅳ能够改善MCAO大鼠神经功能损伤,降低氧化应激水平,改善神经炎症,可能是通过激活PGC-1α/Nrf2信号通路发挥作用的。

基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路探讨黄芪甲苷对过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的研究黄芪甲苷对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)凋亡的保护作用及机制。方法本实验分为正常组、模型组及黄芪甲苷低、中、高(0.4、0.6、0.8μmol/L)剂量组,使用不同浓度黄芪甲苷干预经H_(2)O_(2)诱导的PC12细胞。使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针染色检测PC12细胞内活性氧(ROS)含量,赫斯特荧光染色液(Hoechst33258)染色检测PC12细胞相对凋亡率,蛋白质印迹法(Western blot)检测PC12细胞凋亡相关蛋白及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路关键蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组PC12细胞经H_(2)O_(2)诱导后细胞存活率[(48.53±8.31)%比(100.00±5.61)%,P<0.01]显著下降,细胞内ROS相对含量[(579.77±22.31)%比(100.00±9.76)%,P<0.01]、细胞相对凋亡率[(453.80±49.10)%比(100.00±10.89)%,P<0.01]显著升高,凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相对表达率[(31.87±3.46)%比(100.00±12.38)%,P<0.01]显著下降,半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)[(205.73±9.40)%比(100.00±10.33)%,P<0.01]、Bcl-2相关x蛋白(Bax)[(302.80±19.50)%比(100.00±10.61)%,P<0.01]相对表达率显著升高,磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)[(46.07±3.78)%比(100.00±11.46)%,P<0.01]、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)[(35.70±2.26)%比(100.00±9.66)%,P<0.01]相对表达率显著下降。与模型组比较,经黄芪甲苷干预后的黄芪甲苷中、高剂量组细胞存活率[(65.53±5.30)%、(73.13±6.16)%比(48.53±8.31)%,P<0.05或P<0.01]显著升高,细胞内ROS相对含量[(473.23±40.24)%、(342.27±36.81)%比(579.77±22.31)%,P<0.05或P<0.01]显著下降,细胞相对凋亡率[(366.77±47.65)%、(262.33±48.01)%比(453.80±49.10)%,P<0.05或P<0.01]显著下降,Bcl-2相对表达率[(44.43±6.13)%、(68.57±9.93)%比(31.87±3.46)%,P<0.05或P<0.01]显著升高,Caspase-3[(152.57±7.74)%、(114.40±6.27)%比(205.73±9.40)%,P<0.05或P<0.01]及Bax[(247.67±18.50)%、(182.73±24.14)%比(302.80±19.50)%,P<0.05或P<0.01]相对表达率显著下降,p-PI3K[(61.43±6.38)%、(72.10±5.74)%比(46.07±3.78)%,P<0.05或P<0.01]、p-Akt[(58.10±9.24)%、(69.23±3.40)%比(35.70±2.26)%,P<0.05或P<0.01]相对表达率显著升高。结论中、高剂量黄芪甲苷可通过激活PI3K/Akt信号通路降低经H_(2)O_(2)诱导的PC12细胞的氧化应激及凋亡水平。

黄芪甲苷通过miR-126/NF-κB信号通路调控人牙龈成纤维细胞增殖及凋亡的分子机制

目的 探讨黄芪甲苷对人牙龈成纤维细胞(HGFs)增殖、凋亡的影响及其对miR-126/核转录因子(NF)-κB信号通路的调控作用。方法 采用不同浓度的黄芪甲苷处理HGFs细胞,miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-126转染入HGFs;anti-miR-NC、anti-miR-126分别转染入HGFs后加入黄芪甲苷处理细胞;anti-miR-126转染入HGFs后加入NF-κB抑制剂PDTC与黄芪甲苷共同处理细胞;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-126的表达量;采用Western印迹检测p-p65、磷酸化抑制蛋白κBα(p-IкBα)蛋白表达量。结果 不同浓度的黄芪甲苷可明显提高细胞活力与周期素(Cyclin)D1蛋白水平及miR-126的表达水平明显降低凋亡率及Cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白水平(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-126组细胞活力明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05),而转染anti-miR-126对细胞增殖与凋亡的作用与之相反;抑制miR-126表达可明显逆转黄芪甲苷对细胞增殖、凋亡及NF-κB信号通路的作用;添加PDTC处理后可明显提高细胞活力,明显降低凋亡率(P<0.05)。结论 黄芪甲苷可通过调控miR-126/NF-κB信号通路从而促进HGFs增殖及抑制细胞凋亡。

黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响

背景:多发性硬化初始阶段,中枢免疫细胞激活并释放大量炎症因子,引起白质脱髓鞘甚至累及灰质神经元。CD4^(+)T细胞不同亚群之间的分化平衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病程进展中发挥着重要作用。课题组前期研究结果表明黄芪内有效成分黄芪甲苷能够调节EAE小鼠体内免疫反应,其是否对T细胞亚群分化具有调节作用尚未明确。目的:探究黄芪甲苷对EAE小鼠治疗效果及其对T细胞的免疫调控机制。方法:将C57BL/6雌性小鼠分为正常对照组、EAE疾病模型组和黄芪甲苷治疗组,每组8只,后2组使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)制备EAE模型,免疫后第10-28天,黄芪甲苷治疗组以40 mg/(kg·d)灌胃给药。免疫当天至第28天,记录各组小鼠的体质量及临床评分;免疫后第28天取小鼠脊髓制成冰冻切片行苏木精-伊红染色、固蓝染色观察脊髓病理改变,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群百分比,Western blot法检测脊髓组织中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6的蛋白表达,ELISA检测脾细胞上清液中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6、白细胞介素4水平。结果与结论:(1)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗能够减少EAE小鼠体质量丢失(P<0.05),缓解临床症状(P<0.05),减轻脊髓炎症细胞浸润及髓鞘脱失病理改变(分别为P<0.01和P<0.05);(2)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗可抑制表达γ干扰素和白细胞介素17的CD4^(+)T细胞亚群比例(分别为P<0.001和P<0.001),上调表达白细胞介素10和转化生长因子β的CD4^(+)T细胞亚群百分比(分别为P<0.001和P<0.01);(3)黄芪甲苷可下调脊髓和脾脏中γ干扰素(分别为P<0.05和P<0.01)、白细胞介素17(分别为P<0.05和P<0.05)、白细胞介素6(分别为P<0.05和P<0.05)的表达,上调脾脏中抑炎因子白细胞介素4的表达(P<0.01);(4)结果说明,黄芪甲苷可以减轻EAE小鼠的临床症状,其机制与调节脾脏免疫细胞亚群进而抑制炎症细胞向中枢浸润、减少髓鞘脱失有关。

黄芪甲苷抑制苯并芘相关性腹主动脉瘤形成的机制研究

目的 研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对苯并芘诱导的小鼠腹主动脉瘤(AAA)形成的抑制作用及机制。方法 32只C57/B6小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量AS-Ⅳ组、高剂量AS-Ⅳ组。除对照组外,其余3组小鼠均皮下注射血管紧张素Ⅱ、腹腔注射苯并芘建立AAA模型,低剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组分别予AS-Ⅳ20、80 mg/(kg·d)灌胃处理。4周后取各组小鼠腹主动脉观察大体标本形态,HE染色观察血管结构,检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平,免疫组化法检测靶血管基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达。结果 对照组、模型组、低剂量AS-Ⅳ组及高剂量AS-Ⅳ组的腹主动脉血管周长明显大于对照组(P<0.001),模型组>高剂量AS-Ⅳ组(P<0.05)。HE染色显示动脉瘤形成处弹性纤维紊乱、血管壁变薄。与对照组比较,模型组小鼠血清TC、TG、TNF-α、IL-6水平明显升高(均P<0.01);与模型组比较,低剂量AS-Ⅳ组及高剂量AS-Ⅳ组上述指标水平均下降(均P<0.05)。与模型组比较,高剂量AS-Ⅳ组MMP-2水平明显下降(P<0.01)。结论 AS-Ⅳ对苯并芘诱导的小鼠AAA形成有抑制作用,可能与降低血管壁MMP-2表达有关。

不同产地黄芪饮片中多糖及甲苷含量比较

黄芪是常用补气药之一,黄芪多糖和黄芪甲苷是其发挥药效的物质基础。以黄芪多糖和黄芪甲苷为评价指标,比较甘肃、内蒙古、山西三个不同产地的黄芪饮片的质量差异。结果表明:甘肃黄芪、内蒙古黄芪、山西黄芪的多糖含量分别为22.87%、20.02%、22.29%;甘肃黄芪的黄芪甲苷含量最高,为0.049%;其次是山西黄芪,黄芪甲苷含量为0.026%,内蒙古黄芪中黄芪甲苷含量最低,仅为0.0027%。仅有甘肃黄芪的甲苷含量测定结果符合药典标准。分析认为药材生长年限是导致内蒙古黄芪与甘肃黄芪、山西黄芪甲苷含量之间差异较大的主要原因。该研究为黄芪种植、资源开发及合理使用提供参考依据。

基于线粒体自噬途径探讨黄芪甲苷对阿霉素肾病大鼠的肾保护作用

目的从线粒体自噬角度探讨黄芪甲苷对阿霉素肾病大鼠的肾保护作用,进而阐释中药黄芪“扶补托毒”的护肾机理。方法SD大鼠尾静脉两次注射阿霉素(Adriamycin,ADR)建立ADR肾病大鼠模型。以随机数字法将模型大鼠分为模型组、西药组(洛丁新,0.9 mg·kg^(-1)·d^(-1)),黄芪甲苷低(20 mg·kg^(-1)·d^(-1))、中(40 mg·kg^(-1)·d^(-1))、高(80 mg·kg^(-1)·d^(-1))剂量组,每组8只。另选取8只同龄大鼠为正常组。各组大鼠灌胃给予相对应药物6周,每日1次,正常组与模型组予等容积生理盐水。给药干预后,生化法检测大鼠24 h定量尿蛋白及血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。苏木精-伊红染色法(HE)观察大鼠肾脏病理变化以及采用透射电镜观察肾组织线粒体结构、足细胞形态、数目的变化等。酶联免疫吸附剂法(ELISA)测定试剂盒检测肾组织白细胞介素-1β(IL-1β),活性氧(ROS)水平以及三磷酸腺苷(ATP)含量和线粒体膜电位(冰冻切片)采用化学荧光法检测。Real-time PCR法检测各组肾组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)及核基因18srRNA的含量。Western blot法检测肾脏组织中线粒体自噬蛋LC3、Beclin-1和NLRP3、Caspase-1的蛋白表达。结果与正常组比较,模型组定量24 h尿蛋白,血清ALT、Scr和BUN水平,肾组织IL-1β水平以及LC3、Beclin-1和NLRP3、Caspase-1蛋白表达均显著性升高(P<0.05);血清ALB水平,肾组织ATP水平、mt DNA/18srRNA、膜电位显著降低(P<0.05);且病理结构检测结果显示其肾实质存在损伤病理变化,以及肾组织线粒体发生部分崩解和足细胞足突发生部分融合现象等。与模型组比较,西药组和黄芪甲苷中、高剂量组均能不同程度的改善相关指标,且黄芪甲苷高剂量减轻肾实质病理改变和线粒体微结构损伤最为明显。结论黄芪甲苷能够降低阿霉素肾病大鼠的蛋白尿,改善肾组织线粒体等病理损伤,并抑制炎症以及过度自噬的形成,其肾保护作用可能是通过降低肾脏组织中NLRP3和Caspase-1的表达,进而调控线粒体自噬途径而实现。

HPLC-ELSD-大孔吸附树脂分离法测定黄芪皂苷脂质体的包封率

目的对黄芪皂苷脂质体进行质量评价,测定黄芪皂苷脂质体的包封率。方法采用大孔吸附树脂分离脂质体与游离药物,用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测药物含量,计算包封率。结果该方法在0.026-1.229 mg·mL-1间线性良好(r=0.999 7),精密度小于1.24％,加样回收率在99.97％-101.67％之间,预饱和大孔吸附树脂柱对空白脂质体的平均回收率为100.16％,且能很好保留溶液中及脂质体制剂中游离药物。结论该方法具有操作简单,重现性好的优点。

黄芪甲苷对阿霉素心肌损伤的保护作用及Daxx表达的影响

目的探讨黄芪甲苷对阿霉素诱导的心肌损伤的保护作用及其机制。方法雄性SD大鼠分3组,正常组,模型组和黄芪甲苷处理组;除正常组外,其余各组尾静脉注射阿霉素2.5 mg/kg,隔天1次,共6次,黄芪甲苷处理组同时给予黄芪甲苷30 mg/kg,连续2周。2周后用BL-420E生物机能实验系统采集心内压并分析心功能,检测心肌组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性,常规病理切片,光镜观察,western-blot检测心肌组织死亡结构域相关蛋白(Daxx)的表达。结果与正常组相比,模型组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、SOD和GPX活性下降,MDA含量和Daxx表达升高,病理结果显示:模型组心肌细胞水肿,排列紊乱,纤维断裂,呈灶性坏死。与模型组相比,黄芪甲苷处理组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、SOD和GPX活性升高,MDA含量和Daxx表达降低,病理结果显示心肌组织变性坏死显著减少。结论黄芪甲苷能改善阿霉素心肌损伤大鼠的心功能,减轻其病理改变,其机制可能与其清除氧自由基、抑制细胞凋亡等作用有关。

黄芪甲苷通过调控ET-1对糖氧剥夺致损伤星形胶质细胞中 NLRP3通路的影响

目的:研究黄芪甲苷通过调控内皮素(ET-1)影响星形胶质细胞中NLRP3通路的作用机制。方法:糖氧剥夺构建星形胶质细胞损伤模型,用qRT-PCR检测细胞中ET-1 mRNA表达,鉴定造模成功与否。CCK-8法筛选黄芪甲苷对模型细胞干预的最佳作用浓度(30μmol/L)和时间(24 h)。细胞分为5组:正常对照组、模型组、心钠肽(ET-1抑制剂)组、黄芪甲苷组、联合组。CCK-8检测各组细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达;ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平;Western Blot检测NLRP3通路蛋白NLRP3、Caspase-1表达。结果:与正常对照组比较,模型组细胞增殖能力及Bcl-2蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、炎症因子水平及Bax、Caspase-3 mRNA表达和NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组细胞增殖能力及Bcl-2蛋白表达显著升高,细胞凋亡率、炎症因子水平及Bax、Caspase-3 mRNA表达和NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著降低(P<0.05),其中联合组的效果最显著。结论:黄芪甲苷可通过抑制ET-1表达进而抑制NLRP3信号通路来保护缺血性星形胶质细胞损伤。

黄芪甲苷通过HMGB1/NF-κB通路减轻脓毒症大鼠相关肺损伤

目的 探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对脓毒症大鼠肺损伤的影响及其可能作用机制。方法 选取48只大鼠采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠模型,造模成功大鼠随机分为模型组、AS-Ⅳ低、中和高剂量(20、40、80 mg/kg)组,各12只,另设对照组12只。记录各组大鼠肺湿/干质量比值(W/D);ELISA法检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察各组大鼠肺组织病理变化,评定大鼠肺组织损伤情况;RT-qPCR和Western blot分别检测大鼠肺组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、核因子-κB p65(NF-κB p65)及其磷酸化mRNA和蛋白表达情况。结果 与模型组比较,AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织W/D、TNF-α、IL-1β、IL-6、肺组织病理学评分、HMGB1和NF-κB p65 mRNA水平、HMGB1和p-NF-κB p65蛋白表达水平均降低(P<0.05),以AS-Ⅳ高剂量组效果最佳。结论 AS-Ⅳ能够改善脓毒症大鼠肺组织损伤,减轻炎症反应,可能是通过抑制HMGB1/NF-κB通路,减少NF-κB p65磷酸化蛋白表达发挥作用。

黄芪甲苷抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对牙周炎正畸大鼠牙周组织重塑的影响

目的:探讨黄芪甲苷(AS-IV)对牙周炎(PD)大鼠正畸牙齿移动(OTM)过程中炎症反应和牙周组织重塑的影响及分子机制。方法:18只Wistar雄性大鼠纳入正常对照(NC)组,72只用于结扎法诱导建立PD模型,建模后分为PD组、PD+OTM组、PD+OTM+AS-IV组、PD+OTM+AS-IV+LPS组,每组18只。持续喂养4周,检测牙周组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平,MMP-2、MMP-9、RANKL和OPG mRNA表达,分析牙周组织TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白表达。结果:与NC组相比,PD组大鼠CEJ-ABC距离、牙周组织损伤评分、多核破骨细胞数量、NF-κB p65阳性表达、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值、TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平增加,骨组织骨体积百分比(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)降低(均P<0.05);PD+OTM进一步加剧了PD大鼠上述指标的变化,加重了牙周炎症反应和牙槽骨丢失。PD+OTM+AS-IV组上述指标变化向NC组接近,PD+OTM+AS-IV组上述指标向PD+OTM组接近。结论:AS-IV可抑制炎症反应,减少PD大鼠OTM期间的牙槽骨丢失,改善牙周组织重塑,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

线粒体自噬探讨5-Fu心肌毒性及黄芪甲苷的干预机制

目的 从线粒体自噬角度探讨5-氟尿嘧啶(5-Fu)心肌毒性及黄芪甲苷(AS-Ⅳ)的干预机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞,将细胞分为5组:正常组(A组)、5-Fu模型组(B组)、AS-Ⅳ干预组(C组)、线粒体自噬抑制剂组(D组)、线粒体自噬激活组(E组)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法、TUNEL染色检测心肌细胞功能改变,心肌线粒体腺苷三磷酸(ATP)及膜电位水平观察线粒体功能改变,LC3Ⅱ免疫荧光染色检测线粒体自噬活性,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)检测PINK1/Parkin通路PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、LC3基因及蛋白表达情况。结果各组细胞存活率比较,A组>D组>C组>E组>B组(F=566.153,P<0.05);各组ATP含量、膜电位比较,A组>D组>C组>B组>E组(F=15.967、13.608,P<0.05);各组细胞凋亡率、LC3Ⅱ表达水平、PINK1/Parkin通路相关mRNA表达及蛋白比较,E组>B组>C组>D组>A组(F=92.799、38.130、15.921、7.287、20.921、13.387、5.012、16.824、8.167、23.291、14.622、6.571,P<0.05)。结论 5-Fu可诱导心肌线粒体损伤,且线粒体可呈现自噬过度状态,AS-Ⅳ可通过抑制线粒体自噬减轻5-Fu心肌毒性。

黄芪甲苷对阿霉素诱导心力衰竭大鼠模型心室重构及心肌能量代谢的影响

目的建立阿霉素诱导心力衰竭大鼠模型,观察黄芪甲苷对心力衰竭大鼠心室重构及心肌能量代谢的影响。方法选取雄性SD大鼠40只,进行常规适应性饲养7 d后,随机选择其中10只大鼠作为空白对照组,另将30只大鼠通过阿霉素诱导建立心力衰竭模型,建模成功后随机分为3组,每组各10只,分别设为模型组、曲美他嗪组、黄芪甲苷组;测定各组大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)等心室重塑指标、心肌细胞凋亡指数(AI)及心肌能量代谢指标〔N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白(CTn)I〕。结果模型组大鼠心肌细胞AI较空白对照组增多;经药物治疗后,大鼠心肌细胞AI较模型组减少,其中黄芪甲苷组较曲美他嗪组下降明显(P<0.05)。空白对照组LVEDD、LVESD、NT-proBNP、CTnI值最低,LVEF最高,剩余3组中,依次为黄芪甲苷组、曲美他嗪组、模型组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论经阿霉素诱导的心力衰竭大鼠在经黄芪甲苷治疗后,心肌细胞凋亡抑制效果好,在防治心室重构方面意义重大,大鼠心肌能量代谢改善明显,应用价值高。

黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠的保护作用及机制研究

目的观察黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠肾脏的保护作用,并探讨可能的机制。方法将雄性BALB/c小鼠随机分为对照组(8只)、模型组(8只)和黄芪甲苷组(8只)。采用球后注射阿霉素(10 mg/kg)的方法建立阿霉素肾病小鼠模型,黄芪甲苷组从造模后第2周开始,每日给予黄芪甲苷40 mg/(kg·d)灌胃,共治疗8周。10周时检测各组小鼠尿白蛋白/肌酐(ACR)、血清总蛋白、白蛋白、肌酐、胆固醇、三酰甘油。免疫组化法检测肾组织中Nephrin和Desmin蛋白的表达。结果模型组小鼠尿ACR、血肌酐、胆固醇和三酰甘油显著高于对照组(P<0.01),血清白蛋白水平明显低于对照组(P<0.01)。黄芪甲苷治疗组小鼠尿ACR、血肌酐、胆固醇、三酰甘油水平较模型组显著下降(P<0.05);血清白蛋白水平较模型组升高(P<0.01)。与模型组比较,黄芪甲苷组足细胞Nephrin蛋白表达增强,Desmin蛋白的表达明显减弱(P<0.05)。结论黄芪甲苷可调节足细胞Nephrin和Desmin的表达,显著降低阿霉素肾病小鼠的尿蛋白,改善低蛋白血症,同时降低阿霉素肾病小鼠的血肌酐及血脂水平,发挥肾脏保护作用。