程序降温冷冻保存对血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的 探讨冷冻复苏对人脐静脉内皮细胞的血管内皮细胞生长因子 (VEGF)表达的影响以及在生物血管制品保存中的作用。方法 将人脐静脉内皮细胞株 (ECV30 4 )程序降温冷冻保存后再复苏 ,在不同的复苏时间内应用RT PCR和ELISA检测内皮细胞VEGFmRNA及其相应蛋白的表达。结果 复苏 3d内VEGF的表达显著下降 ,第 4d以后恢复至正常表达水平。结论 冷冻复苏血管内皮细胞孵育 4d后VEGF表达基本恢复正常。程序降温冷冻保存可能在制备具有生物活性的血管代用品上具有重要的作用。

冰箱冷冻法和程序降温仪冷冻法对人类精液冷冻复苏后精子参数的影响

近些年，随着更多的精子库在国内得到卫生部的批准而成立，精液的冷冻技术也有了很大的提高，除了世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）推荐的冷冻方法外[1]，还衍生出了更多的其他精液冷冻方法陋引。

实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷冻和玻璃化冷冻的比较

对 3日龄小鼠胚胎和 5日龄大鼠胚胎进行了玻璃化低温保存和缓慢冷冻保存的比较研究 ,从经过超数排卵的小鼠和大鼠中收集到了 1 897个 8～ 1 6细胞的胚胎 ,经筛选后将 I级和 II级胚计 1 73 8个 (91 .62 % )分别进行两种低温保存试验 ,并对其中的 881个冷冻胚胎分阶段进行复苏 ,复苏率分别为 65 .0 3 % (小鼠 69.5 9% ,大鼠 60 .46% )和 68.45 % (小鼠72 .61 % ,大鼠 64.2 9% ) ,两者间无显著性差异 (P>0 .0 5 )。在复苏的胚胎中 ,选择其中的 488个胚胎进行移植试验 ,结果 ,玻璃化冷冻保存胚胎的移植的受孕率为 3 9.47% (89/ 2 2 2 ) ,缓慢冷冻保存胚胎的移植的受孕率为 42 .5 6% (1 1 5 / 2 66) ,两种低温保存方法经方差检验也无显著性差异 (P>0 .0 5 )

SpermCryo无卵黄冷冻液对食蟹猴精子冷冻保存的影响

为了建立运用商品化人类精子无卵黄冷冻液SpermCryoTM All-round冷冻保存食蟹猴精子的方法,比较了快速(-435℃/min)、中速(-183℃/min)和慢速(-69℃/min)的降温速率以及不同冷冻平衡时间(10和30 min)对食蟹猴精子冷冻保存的效果。结果表明,在液氮上方冷冻平衡10 min对食蟹猴精子的复苏活力显著高于30 min。用快速和中速冷冻速率保存的精子的复苏活力较高,冻存精子的复苏活力明显高于慢速冷冻速率保存的精子。该研究建立和优化的SpermCryo无卵黄冷冻液冷冻保存食蟹猴精子的方法,可简单快速完成精子的冷冻保存,并获得较高的冷冻复苏存活率。该研究结果对深入研究灵长类动物精子冷冻损伤的机制和在辅助生殖中的应用具有重要意义。

红海海绵素A对小鼠精子冷冻活力的影响

目的通过建立最佳的冷冻降温速率，研究红海海绵素A（1atrunculinA，LATA）对精子的冷冻保护作用。方法用冷冻液平衡后的ICR小鼠附睾精子置于液氮面上方不同的位置，用快速（-240℃／min）、中速（-109℃／min）、慢速（一41℃／min）和超陵速（-12℃／min）的降温速率分别冷冻5或10min后投入液氮冻存。结果在液氮上方冷冻5min或10min对小鼠精子的复苏活力没有影响。而用超慢速冷冻速率冻存精子的复苏活力显著高于其他组，中速冷冻速率保存的精子的复苏活力在各实验组中最低。用0．5mmol／L、1mmol／L、2mmol／L和4mmol／L的红海海绵素A处理小鼠精子后，再用趋陵速冷冻速率保存，结果用0．5mmol／L、1mmol／L和2mmol／L的红海海绵素A处理的精子未能提高精子的复苏活力，而高浓度的红海海绵素A（4mmol／L）反而降低了精子的复苏活力度。结论红海海绵素A对精子的冷冻保护作用值得商榷。

新疆驴细管冻精的制作

试验旨在研究新疆驴细管冻精制作过程中精液冷冻液、降温平衡时间及液氮熏蒸时间对精子冻后活力的影响。研究共设计3个试验。试验1对比了INRA-Freeze、Optidyl、房氏驴精液冷冻保存液、自配马精液冷冻冷冻液等4种精液冷冻液在精子冷冻过程对精子冻后活力的影响,筛选出适合制作新疆驴细管冻精的冷冻液;试验2探索在细管冻精制作过程中平衡90、120、150 min对精子冻后活力的影响;试验3比较在细管冻精制作过程中使用液氮熏蒸5、6、7、8、9、10 min时对精子冻后活力的影响,探索液氮熏蒸的最佳时间。结果显示,使用INRA-Freeze冷冻液或房氏冷冻液在冷冻过程中对精子的损伤最小;冷冻过程中,降温平衡90、120、150 min对精子冻后活力的影响差异不显著(P>0.05);在冷冻过程中液氮熏蒸7 min时精子冻后活力最高,显著高于熏蒸5、9、10 min的精子冻后活力(P<0.05),与熏蒸6、8 min时精子冻后活力差异不显著(P>0.05)。研究表明,为降低成本可使用INRA-Freeze冷冻液稀释精液,于冰箱中平衡90~150 min后装入0.5 mL的细管中、液氮熏蒸7 min制作的冻精细管的精子活力最佳。

人胚胎干细胞的保存方法

目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克隆数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性。实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态。方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成。①材料:清洁级孕13.5d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供;kryo-550-16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成。②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞。程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃^-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃^-30℃,每分钟降温0.3℃→-30℃^-150℃,每分钟降温10℃。降至-150℃时置液氮中保存。改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎干细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存。传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存。③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度。鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性。结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81~13.89,P<0.01)。②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P<0.05;t=6.89,P<0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P<0.01;x2=9.69,P<0.01)。③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%。结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性。②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的。

人胚胎干细胞体外培养、传代及冻存、复苏研究

目的建立人胚胎干细胞体外培养模式,并对其进行冻存及复苏。方法将人胚胎干细胞置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,细胞接近融合状态时进行传代,程序降温法冻存,速溶方法复苏,确定解冻后细胞复苏率、克隆生长与分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。结果人胚胎干细胞稳定增殖了5个月,传至20代;细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上呈集落生长,核大,核仁明显。程序降温法冻存后复苏,细胞复苏率达到78.3%;解冻后第12代细胞仍具有稳定的46,XX核型;TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为89.38%。结论成功建立了人胚胎干细胞体外培养模式,为研究人胚胎干细胞及相关疾病的防治提供细胞模型和细胞来源。