微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染法的改良

为了筛选和检测绵羊种群中具有较好表现的微卫星多态性,采用Touch-downPCR方法扩增绵羊基因组上的微卫星DNA序列后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,采用改良的银染法对微卫星位点进行多态性检测,染色结果与常规银染法相比,该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。

普通PCR与TD-PCR在临床医学科研中应用价值的比较

目的比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR,TD-PCR)在临床医学科研中的价值。方法以人类外周血基因组DNA为模板,设计VHL基因3个外显子的3对引物,根据普通PCR及TD-PCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序,通过试验选择PCR最佳反应条件,在同一程序中分别对3个片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,纯化后PCR产物测序分析两种试验方法的差别。结果电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TD-PCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高。结论成功建立了TD-PCR方法,TD-PCR方法较普通PCR更为高效实用,为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段。

运用降落PCR同时快速检测NV、EV71和CoxA16病毒

目的运用降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)技术快速从腹泻、手足口病人粪便标本中同时检测诺如病毒(Norovius,NV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71 EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16),并评价该技术用于检测这3种病毒的效能和敏感性。结论根据touchdown PCR原理设计TD-PCR程序,试验选择最佳反应条件,与普通PCR扩增效果进行评价。用10倍稀释检验TD-PCR方法的灵敏度,并用轮状病毒、札幌病毒、星状病毒、伤寒杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、香港海鸥形菌检测该方法的特异性。结果 TD-PCR能在一个反应条件下同时检测NV、EV71和CoxA16,扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,测序证实了3组片段的特异性,3种病毒cDNA的最低检测浓度分别为4.775μg/ml、2.360μg/ml、43.273μg/ml。检测该方法特异性时,其他病原体未见特异性条带扩增。结论成功建立的TD-PCR方法可同时检测腹泻和手足口病人粪便中NV、EV71和CoxA163种病毒,为快速检测相关病原体、科学防治腹泻和手足口病疫情暴发提供了可靠手段。

2017年临床分离阴沟肠杆菌的耐药性及其ESBLs基因研究

目的探讨某三级甲等医院2017年临床分离阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药性及其超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)基因的产生情况。方法收集2017年1月-2017年12月自临床患者分离的159株(非重复菌株)阴沟肠杆菌。菌株鉴定及药敏试验采用Walkway 96全自动细菌鉴定及药敏仪,K-B法补充部分药敏试验。ESBLs表型检测采用双纸片扩散法,降落聚合酶链反应(PCR)检测4种ESBLs基因(blaOXA-1、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV)。结果未检出对亚胺培南和美罗培南耐药的阴沟肠杆菌,菌株对其他抗菌药物的耐药率均<30%;38株(23.9%)阴沟肠杆菌ESBLs表型试验阳性,其中,35株携带ESBLs基因,以CTX-M-3型(28/35)为主;产酶(ESBLs)菌株对多数β-内酰胺类抗菌药物的耐药现象较严峻。结论ESBLs表型检测可作为阴沟肠杆菌产ESBLs与否的筛选试验;降落PCR用于ESBLs基因检测简便、快捷;本地区阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药率略低,但产酶菌株耐药现象较严峻,临床医师应根据药敏试验结果合理选择抗菌药物,以减少耐药菌株的产生。

TD-PCR技术用于肠道病毒71的检测

目的评价降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)检测肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的效能和敏感性。方法根据touchdown原理设计TD-PCR程序,试验选择PCR最佳反应条件,分别与普通PCR及TD-PCR、普通Taq酶与热启动酶扩增效果进行比较,并利用10倍稀释法检验TD-PCR方法的灵敏度。琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物,纯化后DNA产物测序验证该方法的特异性。结果 TD-PCR的扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,使用普通Taq酶的TD-PCR比使用热启动酶有更优的性价比,测序证实了此组片段的特异性,cDNA的最低检测浓度为1.031μg/mL。结论成功建立TD-PCR检测EV71的方法,使用普通Taq酶获得理想的检测结果,为快速检测手足口病的病原体提供了可靠的手段。