金钱菇中降血压肽的纯化和磁性脂质体分离鉴定

为了从金钱菇中快速分离出降血压肽,利用超声细胞破碎法提取金钱菇蛋白,采用透析、超滤的方法对提取物进行纯化,以固定化金属亲和磁性脂质体(metal affinity-immobilied magnetic liposome,MA-IML)作为吸附介质,以金钱菇提取物为吸附对象,吸附分离其中的降血压肽,并解析其结构,利用分子对接分析其结合血管紧张素I转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)的能力。结果表明:对金钱菇提取液用透析、超滤的方法进行纯化后,蛋白含量由37.67%提高至51.18%,多糖含量由26.80%降低至6.90%,ACE抑制率由61.83%提高至79.77%,纯化后更有利于分离降血压肽;用MA-IML粒子吸附分离出金钱菇纯化液中的降血压活性组分,经反相高效液相色谱法分析其为单一组分,该组分为五肽,其氨基酸序列为苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-丙氨酸-酪氨酸(Phe-Ala-Trp-Ala-Tyr,FAWAY),IC50为179μmol/L。分子对接模拟表明,FAWAY能与ACE自发发生结合并形成稳定的构象。该研究制备的MA-IML可作为从金钱菇中分离降血压肽的有效工具。

重组降血压肽ACEIP的表达及活性鉴定

选择降血压肽WQVLPNAVPAK,人工合成大肠杆菌密码子优化后六串联体血管紧张素转换酶抑制肽(angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP)基因片段ACEIP,将其克隆至表达载体pET30a后构建重组质粒pET30a-ACEIP。该重组质粒经限制性内切酶Nde I和HindIII双酶切鉴定、菌落聚合酶链式反应鉴定后,将其化转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,构建了表达工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-ACEIP。工程菌经终浓度为0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷导后,Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在分子质量约为8.7 kDa处出现一条明显条带。经Ni^(2+)亲和层析、肠激酶酶切后纯化得到串联多肽ACEIP。其中融合蛋白的表达量为61.30 mg/L,串联多肽ACEIP的表达量为57.84 mg/L。串联多肽经胰蛋白酶酶解后的IC_(50)值为6.39 mg/m L,ACE抑制活性高于单体肽WQVLPNAVPAK的抑制活性(IC_(50)为12.34 mg/mL)。

降血压肽前体的设计和克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的降血压肽(antihypertensive peptide,AP)是一类能降低人体血压的小分子肽,是血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin convering enzyme inhibitor,ACEI),可通过抑制体内血管紧张素Ⅱ的生成达到降低血压的目的。AP通常含有少数几个氨基酸残基,难以直接表达,因此文中设计含多种降压活性肽段的AP前体(antihypertensive peptide precursor,APP),构建原核表达载体,并在所构建的基因工程菌进行表达。方法筛选多种已报道的具有高体内降压活性的AP,经胃肠消化酶酶切位点串联成APP。基于大肠埃希菌偏爱密码子,人工合成相应的多肽基因(app),PCR扩增,克隆至表达载体pET-22b,转化E.coliBL21感受态细胞。重组质粒经双酶切和DNA测序鉴定,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(sopropylβ-D-1-thiogalactopyr-anoside,IPTG)诱导表达重组APP。结果 APP基因正确克隆至表达载体pET-22b中。诱导表达产物经SDS-PAGE分析,显示在相对分子质量11000处出现条带,与预期的重组APP大小相符。结论人工设计的APP在大肠埃希菌中获得成功表达,为AP的工业化制备打下基础。

降血压肽的构效关系研究

降血压肽的活性与其氨基酸组成和氨基酸序列有重要的关系。然而,关于降血压肽的构效关系至今尚未清楚。通过对收集的270种降血压肽的氨基酸组成进行分析,研究降血压肽的构效关系以及如何选择蛋白酶和蛋白原料用酶解方法制备降血压肽。结果表明:降血压肽中,N端氨基酸主要为Arg、Tyr、Gly、Val、AlaI、le和Leu;C端氨基酸主要为Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu;与降血压肽的N端氨基酸特征相比,其C端氨基酸特征对降血压活性影响更为重要。根据降血压肽的构效关系可以看出,在选择蛋白酶和蛋白原料制备降血压肽时,优先选择酶切位点为Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu羧基端的蛋白酶以及富含Tyr、Val、AlaI、le、Leu、Pro、Trp和Phe的蛋白。

超声波在酶法生产紫菜降血压肽过程中的应用

为从紫菜蛋白中制备降血压肽,采用8种商业蛋白酶进行筛选,确定了以中性蛋白酶作为水解用酶和相应的酶解条件.研究了超声波处理紫菜蛋白后对酶解过程的影响,超声波处理后紫菜蛋白水溶液中游离氨基酸、酸溶性肽的质量浓度未变化,紫菜蛋白的紫外可见差示光谱也未出现变化;超声波处理的紫菜蛋白经酶解的产物,与未超声处理紫菜蛋白在同样条件酶解的产物相比,水解度增加1.1倍,IC50值降低29.5%.结果表明,超声处理没有破坏紫菜蛋白的分子结构,可能使它的分子空间构象发生变化,更加容易与酶分子结合,促进了酶解的进程.

从麦胚蛋白质中制备降血压肽的研究

用超临界CO2对小麦胚芽脱脂,碱溶酸沉淀法提取麦胚蛋白,用8种蛋白酶分别进行单一酶和复合酶水解麦胚蛋白生产降血压肽,用高效毛细管电泳(HPCE)测定其活性。碱性蛋白酶生产水解物的活性最大,其对麦胚蛋白作用的最适pH为9,温度为50～55℃,加酶量为24AU/kg,水解度为16.5%时所得水解物对ACE有强烈抑制用。

降血压肽研究进展

血管紧张素转化酶在血压调节中起到重要作用,降血压肽通过抑制该酶的活性达到降血压的目的。文中在介绍降血压肽作用机理的基础上,综述了其制备方法、检测方法以及原料来源等方面的研究进展,并展望了其开发应用的前景。

玉米降血压肽的分离纯化研究

以玉米蛋白为原料酶解得到的酶解液具有降血压活性,为了得到高活性的降血压肽单体,本文采用了离子交换层析法、凝胶层析和RP-HPLC对酶解液进行了的分离纯化,得到了五个降血压多肽单体。

酪蛋白源降血压肽稳定性及其抑制作用机理的研究

酪蛋白源降血压肽经体外胃肠道蛋白酶消化后,其ACE抑制活性仍能保持原来活性的94%。降血压肽与ACE作用前后,其ACE抑制活性和肽谱基本保持不变,证实了酶解乳蛋白源降血压肽是真正的抑制剂类型,不受ACE作用。采用抑制酶解动力学方法,初步探讨降血压肽的抑制作用机理,根据lineweaver-Burk方程,确定酶解酪蛋白源降血压肽是非竞争性抑制类型。

酶解马氏珠母贝肉制备降血压肽工艺条件优化

以马氏珠母贝(Pinctada martensii)肉为原料,选用6种蛋白酶在各自适宜的条件下进行酶解,采用HPLC法分析酶解产物对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制活性(IP),筛选出碱性蛋白酶为其制备的最佳酶种类,并确定了水解度为21%时,产物具有较好的抑制活性。在此基础上,分别考察了加酶量,底物浓度,酶解温度及pH对水解度的影响。结果表明:当加酶量为0.175 g/L,底物浓度为35 g/L,温度为45℃,pH为9.5,水解时间240 min为酶解最适宜工艺条件。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子质量分布,表明酶解产物中主要为14.4 ku以下的多肽分子。

酶法水解苦荞麸皮蛋白生产降血压肽

苦荞具有很高的营养价值和保健功能,这已被许多的动物学实验、临床实验、流行病学调查结果所证实,本文试图通过酶法水解苦荞麸皮蛋白研究其降血压作用,从而为降血压功能提供科学的证据。

酶解玉米蛋白制备降血压肽的研究

以玉米蛋白粉为原料,选用7种蛋白酶分别进行单一酶和复合酶水解生产玉米蛋白降血压肽,用Cushman紫外分光光度法测定水解液的ACE抑制活性。结果表明,碱性蛋白酶Alcalase2.4L水解液具有最大的ACE抑制率,水解条件优化实验确定最适pH为8.0,温度为55～60℃,底物浓度为2.5%,加酶量为48AU/kg。水解度15.96%时所得水解物对ACE抑制作用最强,IC50为0.125mg/mL。

降血压肽分离的研究现状与展望

通过凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法将不同来源的降血压肽进行分离,以得到结构明确的短肽片断,之后进行活性检测,从而为降血压机理的研究以及高血压的治疗提供了途径,并有望开发成降血压类功能食品。本论文概述了不同食物来源降血压肽国内外分离提纯研究的意义、现状及展望。

贻贝蛋白酶解降血压肽的降压活性及相对分子质量与氨基酸组成

以贻贝(Mytilus coruscus)为原料制取降血压肽,采用均匀设计试验探讨了不同酶解条件对其ACE(angiotensin-converting enzyme)抑制活性的影响,利用高效液相色谱分析了其相对分子质量分布,以氨基酸自动分析仪分析其氨基酸和游离氨基酸组成;并利用自发性高血压大鼠(SHR)饲喂试验检测其降血压活性。结果表明,对于P1酶来说,酶量从25-175IU.mL-1,酶解时间从2-7h,随着酶解程度的提高,其ACE抑制率下降;其最高的ACE抑制率为88.08%,对应的最佳酶解条件为:酶量25IU.mL-1,酶解时间2h,pH7.0,酶解温度60℃。此外发现降血压肽的相对分子质量在1.6ku以下,其中10肽以下的短肽约占50.4%,证实了降血压肽主要以分子量较小的短肽组成。降血压肽游离氨基含量为8.8g.(100g)-1,水解氨基酸总量为59.6g.(100g)-1,疏水性氨基酸含量为24.86g.(100g)-1,氨基酸组成比例平衡,必需氨基酸含量丰富,其中含量最高的氨基酸是谷氨酸,占8.57%。此外以3.0g.kg-1体重的降血压肽样品剂量饲喂SHR,在饲喂后2-6h降压效果显著,平均降低幅度为18-28mmHg(P=0.05)。研究表明以贻贝等水产蛋白为原料可开发具有高ACE抑制活性和显著降血压作用的降血压肽。

食品蛋白降血压肽及其研究进展

食品降血压肽已成为生物活性肽研究领域的热点。综述血管紧张素转化酶对血压的调节作用、降血压肽的降血压机理和降血压肽结构与抑制ACE的关系,介绍了食品降血压肽的制备及分离纯化方法。

酶法水解和筛选蛋黄蛋白质中的药物前驱型降血压肽

为了筛选鸡蛋蛋黄蛋白质的酶解产物中的药物前驱型降血压肽，将鸡蛋蛋黄蛋白质经超临界CO2-乙醇萃取脱脂和NaOH溶液脱磷处理，用12种蛋白酶在各自适宜的条件下进行酶解，采用HPLC分析各酶解产物对血管紧张素酶（ACE）的抑制活性（IC50），并对IC50较小的6种水解产物进行保温实验，筛选药物前驱型降血压肽。结果显示，12种酶解产物对ACE的IC50值在0．69mg·mL^-1～4．06mg·mL^-1；保温实验显示仅有酶L的酶解产物IC50值明显减小，即由1．19mg·mL^-1降至0．59mg·mL^-1，其他5种酶解产物的IC50值则保持不变或升高，表明酶L的酶解产物中含药物前驱型降血压肽。

猪股骨头胶原蛋白降血压肽的分离纯化

依次采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对猪股骨头胶原蛋白进行酶解,制备降血压肽。为了得到高活性、高纯度的降血压肽,依次采用超滤、离子交换层析、凝胶层析对酶解液进行分离纯化,采用体外检测方法测定各分离产物对血管紧张素转化酶活性的半抑制浓度(IC50值)。结果显示:猪骨酶解液经超滤分离获得分子质量小于5 ku的组分对血管紧张素转化酶的抑制活性最高,IC50值为1.400 2 mg/mL;该组分进行离子交换层析分离得4个组分,其中组分2的活性最高,IC50值为0.488 4 mg/mL;再将组分2进行凝胶层析分离得4个组分,其中组分2-2的活性最高,IC50值为0.195 3 mg/mL。

玉米蛋白制备降血压肽的研究

本实验以我国来源丰富且价格低廉的玉米蛋白为原料,选用嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶等4种酶来水解玉米蛋白制备降血压肽。选用马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为血管紧张素转化酶(ACE)的模拟底物,利用反相高效液相色谱(RHPLC)检测ACE催化反应生成的马尿酸(Hip)的量,确定水解产物的ACE抑制活性从而来对酶进行筛选。研究结果表明,碱性蛋白酶的水解能力最强,碱性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的水解产物都达到了很好的ACE抑制活性(90%左右)。

食品蛋白质中降血压肽的功能与应用

综述了血管紧张素转化酶抑制剂降血压机理和食品蛋白质中降血压肽的功能 。

响应面法优化酶解花椒籽蛋白制备降血压肽工艺

利用响应面法优化酶解花椒籽蛋白制备降血压肽的工艺条件。采用不同蛋白酶水解花椒籽蛋白,以酶解物对血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制率为指标,筛选出制备花椒籽蛋白降血压肽的最佳蛋白酶。在单因素试验基础上,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,考察酶解时间、加酶量、酶解温度和p H值对血管紧张素转换酶抑制率的影响。结果表明:回归模型能较好地反映各因素水平与响应值之间的关系,并获得酶解花椒籽蛋白制备降血压肽的最佳工艺条件为:底物质量浓度3 g/100 m L、酶解时间4.9 h、加酶量10 200 U/g、酶解温度37.4℃、p H 6.9,在此条件下,所得酶解产物的ACE抑制率为68.00%。