动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性方法的建立

目的建立一种动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性的方法。方法将表达绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed_2)的质粒分别改建为表达带有内泛素-蛋白酶体系统降解信号CL1的GFP或DsRed_2的pGFP^u或pDsRed_2~u质粒,然后转染HEK293细胞,通过G418筛选得到稳定表达GFP^u或DsRed_2~u的细胞系。在蛋白酶体抑制剂N-Acetyl-Leu-Leu-Norleu-al(ALLN)处理GFP^u或DsRed_2~u细胞后,应用免疫印记技术检测细胞内GFP或DsRed_2含量的变化,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜技术观察GFP或DsRed_2荧光强度的变化。结果ALLN处理能使GFP^u和DsRed_2~u细胞内GFP和DsRed_2含量明显增加,荧光强度显著增强,并呈现明显的剂量/时间-效应关系。结论本文成功地建立了检测内泛素-蛋白酶体系统活性的方法,该方法能有效地对活细胞的内泛素-蛋白酶体系统活性进行实时动态检测。

海洋微生物ZD02信号降解酶基因aiiA克隆及其生物信息学分析

根据细菌群体感应信号降解酶(AiiA)基因设计简并引物,从海洋微生物ZD02基因组中扩增编码AiiA的基因aiiA,筛选其阳性克隆,测序后分析其基因序列。结果表明:筛选到的阳性克隆ZD02-aiiA序列全长753bp(Genbank登录号:KC756214),存在一个开放阅读框(ORF),编码由250个氨基酸残基组成的多肽,预测分子量为28.1kDa,蛋白等电点为4.78。由该序列推导得到的氨基酸残基序列含有一个保守结构域(Lactamase-B)(34AA～235AA),并预测了AiiA的三级结构。以上研究为该序列的重组表达及其相关活性研究奠定了基础。

海洋微生物信号降解酶基因aiiA克隆与表达载体的构建

根据已知的微生物信号降解酶基因aiiA的序列设计、合成特异性引物探针,以从海洋分离的微生物ZD02的基因组为模板,PCR扩增编码蛋白aiiA信号降解酶的基因aiiA序列,产物经PCR验证后用于构建克隆载体pMD18-ZD02aiiA,并以此克隆载体为模板,以带酶切位点的引物扩增基因,经BamHI和EcoRI双酶切后将其插入表达载体pET-17b,构建原核表达质粒pET-ZD02aiiA。经酶切、PCR鉴定及序列测定等,结果表明:克隆基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框正确,为海洋微生物ZD02信号降解酶基因的体外重组和诱导表达研究打下基础。

微生物信号分子降解酶研究进展

微生物细胞之间存在的信息交流称为群体感应。群体感应在实现微生物的生物学功能方面具有重要作用,包括调节致病性、参与生物膜的形成等。微生物能够分泌特定的信号分子,通过对信号分子的检测及应答,调控目的基因的表达。抑制信号分子的积累,能够干扰群体感应系统,使微生物丧失生物学功能。研究较为全面的一类信号分子是酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserine lactone,AHL),此类信号分子可以通过酶法降解。目前已鉴定出的AHL降解酶主要分为AHL内酯酶和AHL酰化酶两类。综述了信号分子降解酶的来源、筛选方法、纯化技术、酶学性质、作用机制及在病害防治方面的应用。对信号分子降解酶的研究有助于完善群体感应系统的调控机制,并为微生物疾病的防治提供新策略。