污染土壤中主要石油降解基因AlkB和Nah定量检测方法的建立和应用

建立了SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time-qPCR)检测油田污染土壤中烷烃降解基因AlkB和萘降解基因Nah的方法。比对相关降解石油菌株的GenBank序列,设计合成针对烷烃和萘降解基因扩增引物AlkBf/AlkBr和Nahf/Nahr。将纯化的常规PCR胶回收产物与pEASY-T1载体连接,转化到感受态细胞培养。提取并梯度稀释阳性克隆质粒,构建Real Time-qPCR标准测定曲线。25μL扩增体系最佳反应条件:前后引物终浓度为0.2μmol/L,12.5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix,AlkB和Nah基因最适退火温度分别为50℃和57℃。Real Time-qPCR技术显示出很高的灵敏性和重复性,比传统PCR技术灵敏度高100倍。对采集于某油田3个功能区的14土壤样品中AlkB定量检测显示,石油污染严重的采油区含有最高的AlkB拷贝数,污染较轻的生活区AlkB拷贝数最少;Nah基因分布均匀。

外源降解基因和菌群刺激土著关键物种抵御1,4-二氯苯胁迫研究

有机氯农药污染场地危害人体健康及生态系统安全,高活性降解微生物对提升土壤有机氯农药降解效率十分必要。本研究结合高通量测序和荧光定量PCR技术,探究添加分别表达二氯苯降解基因(xylH、dmpB、catE)的质粒pUC19(10^(2)~10^(3)copies/μL)和菌群(单独表达上述质粒的大肠杆菌E.coli DH5α,10^(5)~10^(6)CFU/μL)后,土壤中1,4-二氯苯降解动力学、微生物群落组成与降解功能演变。研究发现:添加降解基因及菌群210 d后,土壤中1,4-二氯苯降解效率提升1.74倍~2.41倍,最高分别达38.43%和44.74%;优势菌门及关键物种相对丰度占比显著上升(P<0.05);土著菌群降解基因绝对丰度显著上升了1.24倍~2.89倍,添加降解菌群上升幅度更显著(P<0.05)。本研究有助于探明外源添加降解基因及菌群后土著菌群应对污染胁迫的响应机制,为调控和优化农药污染土壤修复过程及效果提供技术支持。

多环芳烃微生物降解基因的研究进展

多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物,微生物的降解是PAHs去除的主要途径。近年来,有关PAHs微生物降解途径和代谢产物的研究已有很多报道。小分子PAHs一般可以直接被微生物降解,而大分子PAHs则需要微生物以共代谢的方式降解。在过去20年中,微生物降解PAHs的基因相继被发现,各种基因在调控PAHs降解过程中的功能也越来越清晰。本文概述了PAHs微生物降解基因方面的研究进展,详细介绍了微生物对萘、菲的降解基因,最后对PAHs微生物降解基因的应用前景进行了展望。

环境中污染物降解基因的水平转移(HGT)及其在生物修复中的作用

水平基因转移是不同于垂直基因转移的遗传物质的交流方式。在污染环境这一特异生态环境中,降解基因的水平转移有着独特的功能与作用。研究环境中污染物降解基因在微生物间的水平转移,更深入地了解微生物种群适应污染环境的机理,对于评价污染物的环境毒理、生物可降解性以及污染环境的可修复潜力具有重要参考价值。在污染物生物修复实践中,可以通过调控降解基因的水平转移,增强污染环境中微生物的降解能力,更有效地发挥生物修复作用。文章将对环境中细菌间基因交流的机制,污染物降解基因的水平转移对微生物适应污染环境的机理、水平基因转移对代谢途径的进化及其对污染物生物修复作用的影响等方面的研究进展做一综述。

苯酚的生物降解基因组成及其调控机制

苯酚的生物降解受多组分的降解基因控制 ,形成邻位和间位等不同的代谢途径。结合部分实验结果 ,介绍了邻位和间位代谢系统的基因组成及其作用机制等方面的研究进展 。

扑草净降解菌降解特性、降解基因保守序列的扩增及同源性分析

从受污染农田中分离到一株扑草净降解菌FR ,经鉴定属于假单胞菌 ,考察了温度及pH对其降解能力的影响 ,确定pH 7.0 ,32℃为最适作用条件 ;设计引物 ,通过PCR扩增得到一条长度约为 5 0 0bp的降解基因保守片段 ,通过对该片段部分序列测定及同源性搜索 ,证实该片段与atzA、triA等均三嗪化合物水解酶基因具有很高的同源性。

铜绿假单胞菌PIC－N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以禁为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒，经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段，用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌质粒ｐＭＦＹ４３上，获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组质粒进行限制酶分析，绘出了该质粒ＨｉｎｄⅢ内切酶７个切点的酶切图谱。

藤黄微球菌AD3的阿特拉津降解基因检测与分析

为了获得高效稳定的阿特拉津基因,分离出更多的阿特拉津降解菌,试验采用PCR基因扩增和氮源利用方法,对AD3菌株的阿特拉津降解基因进行了检测和测序,并与其他菌株阿特拉津降解基因的序列进行了比较。结果表明:Micrococcus luteus AD3菌株含有阿特拉津降解基因trzN,atzB,atzC和atzDEF。其中trzN基因中心区的序列与Arthrobacter sp.TC1的trzN完全相同,atzB和atzC基因中心区的序列与Pseudomonas sp.ADP的atzB和atzC完全相同。AD3菌株能以氰脲酸为唯一氮源生长,Micrococcus luteus AD3菌株能将阿特拉津彻底降解成CO2和NH3。

石油烃厌氧降解基因masD和bamA实时荧光定量PCR方法的建立及应用

masD和bamA基因分别是烷烃和芳烃厌氧降解的关键基因。本研究建立了这两种基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。通过参考相关石油烃厌氧降解菌株的Gen Bank序列,利用Primer express软件设计烷烃和芳烃厌氧降解基因的扩增引物masD-f、masD-r和bamA-f、bamA-r。经过常规PCR扩增分别得到片段大小为389和354 bp扩增产物,经测序并在NCBI数据库查询,确定为masD和bamA片段。通过实时荧光定量PCR构建测定这两种基因的标准曲线。优化后的扩增体系(25μL)为:12.5μL 2×Trans Start Top Green qPCR Super Mix,引物浓度为0. 2μmol/L,masD和bamA基因最适退火温度分别为52℃和56℃。建立的两种基因的实时荧光定量PCR检测方法具有非常好的重复性,其灵敏度比传统PCR技术高100倍。对于氧化石墨烯促进石油烃的厌氧降解体系中厌氧基因的定量检测显示,添加不同浓度的石墨烯均促进了bamA拷贝数的增加,但对masD的拷贝数无显著影响。

不同污染强度下PAHs降解基因在土壤-根表-植物系统中的分布

[目的]本文旨在解析植物-微生物联合修复多环芳烃(PAHs)污染土壤的分子机制,并为在PAHs污染区生产安全的农产品提供技术支持和理论依据。[方法]以紫花苜蓿为供试植物,以菲和芘作为供试PAHs,以PAHs降解菌株Sphingobium sp.RS2为供试菌株,在根箱装置中进行温室盆栽试验,通过高效液相色谱技术和实时荧光定量PCR技术,研究不同PAHs污染浓度对种植紫花苜蓿的土壤-根表-植物系统中PAHs降解基因丰度和分布的影响。[结果]高浓度PAHs污染对紫花苜蓿的生长有抑制作用,而接种功能菌株RS2可以促进紫花苜蓿的生长。与未接种RS2的对照组相比,接种RS2的处理组紫花苜蓿生物量平均增加约22.4%。根际土壤中PAHs残留量显著低于非根际土壤。随PAHs污染浓度增加,降解基因丰度也增加。根表部位降解基因丰度最高,各层室土壤次之,植物根部和茎叶部丰度最低;在同一采样区域中,phe基因丰度显著高于nahAc和nidA基因。菲、芘残留量与nahAc基因丰度呈显著正相关。[结论]在土壤-根表-植物系统中,PAHs降解基因的丰度受PAHs浓度的影响,且根表环境中PAHs降解基因丰度最高,是PAHs代谢最为旺盛的区域。根表的PAHs代谢在去除土壤PAHs污染以及减低植物PAHs污染风险中起着不可替代的作用。

菌株Enterobacter sp.降解除草剂阿特拉津产物测定及降解基因克隆

为解析除草剂阿特拉津的生物降解过程,采用液相色谱与质谱联用技术对菌株Enterobacter sp.降解阿特拉津的产物进行检测,通过PCR扩增技术克隆降解基因,并利用GO功能富集分析对降解基因功能进行检测。在降解产物中先后检测出羟基阿特拉津、氰尿酸和尿素组分,克隆出降解基因L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA。初步推测菌株Enterobacter sp.在降解基因的作用下,经脱氯、脱烷基、脱氨基、环裂解、脱羧和脲基甲酸水解等过程,将阿特拉津逐步矿化。

石油烃厌氧降解关键基因masD和bamA的实时荧光定量PCR检测方法与应用

masD和bamA是控制石油烃厌氧降解的关键基因,利用实时荧光定量PCR技术检测masD和bamA基因具有简便快速和易操作等优点.但目前所用方法存在扩增效率低,方法灵敏度较差的问题.本文根据引物设计原则,利用Allele ID6软件重新设计了扩增masD和bamA的实时荧光定量PCR引物,将质粒DNA进行8次10倍梯度稀释后构建实时荧光定量PCR标准曲线.优化后的体系(20μL)为:FastStart Essential DNA Green Master 10.0μL,上下游引物各0.4μL,RNase-Free Water 4.2μL,5.0μL DNA模板.利用新设计的引物扩增masD和bamA基因的最适退火温度分别为61℃和57℃.优化后的检测方法扩增效率提高至97.5%和71.2%,比文献报道的方法提高了7.6%—44.5%,具有更高的重复性和灵敏度.利用设计的引物对陕北5个地区石油污染土壤中的masD和bamA基因进行定量检测结果表明,石油污染土壤中普遍存在着控制石油烃厌氧降解的关键基因,所测定的土壤中bamA降解基因的拷贝数远高于masD降解基因.

降解菌Pseudomonas sp. AT2对莠去津胁迫下水稻生长的影响机制

农田土壤中残留的莠去津易对后茬敏感作物造成药害,利用功能微生物调控作物中残留莠去津降解是缓解其药害的有效方式。本研究分析了水稻根际微生物群落及土壤中莠去津降解基因对莠去津胁迫的响应,并从水稻根际土壤中分离出一株莠去津降解菌Pseudomonas sp.AT2,通过盆栽试验探究了莠去津胁迫下菌株AT2对水稻生长及莠去津降解的影响机制。结果表明:莠去津胁迫可显著改变水稻根际细菌的群落结构,并提高根际土壤中莠去津降解基因TrzN、AtzB和AtzC的丰度。莠去津胁迫下,接种降解菌AT2组水稻的株高、根长、干重和叶绿素含量均显著增加,MDA的积累减少,说明AT2可缓解水稻的氧化胁迫损伤;接种降解菌AT2处理组土壤和水稻中莠去津含量分别比对照降低了14.9%和47.1%~57.5%,说明AT2促进了土壤及水稻中莠去津的降解。另外,莠去津胁迫下,接种AT2还可诱导水稻中莠去津降解基因的上调表达,表达量为未接菌对照组的1.3~2.7倍。研究表明,根际接种降解菌株能激活水稻体内降解基因的表达,促进“土壤-水稻”体系中莠去津的降解,缓解环境中残留莠去津对水稻的毒害作用。

拟南芥叶片衰老前后叶绿素降解代谢基因表达和酶积累的模式及其影响因素分析

由叶绿素降解引起的叶片衰老褪绿不仅是植物衰老最直观的性状,还是植物进行营养动员的关键事件。近年来,进入衰老窗口(senescence window)后的叶片中叶绿素降解代谢酶基因(Chl catabolic genes,CCGs)的表达调控已经得到了较为充分的研究,但在未衰老叶片中对CCGs表达模式的研究还鲜见报道。本研究中,我们分析了主要叶绿素降解代谢酶(Chl Catabolic Enzymes,CCEs)及其编码基因CCGs在自然衰老以及未衰老的拟南芥叶片中的表达模式。研究结果显示,在叶片自然衰老过程中,CCGs剧烈上调表达且CCEs蛋白逐渐累积,以催化衰老细胞中叶绿素的大量降解;值得注意的是,在长日照培养条件下,未衰老叶片中CCGs的表达存在显著的波动,其表达量在光照开启后开始上升,10:00~16:00之间达到峰值后逐渐下降。我们的分析显示,CCGs表达量的波动很有可能是光-暗交替导致的,与CCA1介导的节律信号没有明显的相关性。我们的研究结果提示,外界光信号对未衰老叶片中CCGs的表达调控起至关重要的作用。

石油降解菌的筛选、降解特性及其与基因的相关性研究

以Bush．hass培养基为筛选培养基，从3种不同来源的石油污染土壤中富集、分离、筛选获得16株可以以石油烃为唯一碳源的菌株。对菌株的生理生化性质、石油烃降解效果、菌株种属和菌株所含石油烃降解基因进行了检测。结果表明，筛选出的16株菌分属于铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）和不能确定种名的假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）和无色杆菌属（Achromobacter）的细菌。其中7株菌株对水相中石油烃的降解率在降解时间为20d时可达到31．5％-54．7％。对菌株的降解基因检测结果表明，当降解菌中同时含有双加氧酶和单加氧酶控制基因时，菌株对石油烃显示出较强的降解能力。

萘降解细菌的分离及其降解和转座基因的分子检测

用富集培养法，从工业废水和活性污泥中分离到9个高效降解萘的细菌菌株（ND7～ND15）．对菌株ND7、ND8、ND9和ND10所进行的16SrDNA序列分析表明，它们都属于假单胞菌属（Pseudomonas）．PCR实验结果表明，上述4个菌株都含有蔡降解基因nahAc、nahG、nahH和catA，ND7和ND8菌株还含有萘降解基因nahU.DNA杂交实验结果表明，上述9个萘降解菌株都含有转座酶基因tnpA1和解体酶基因tnpR．这些结果表明，萘降解细菌的降解基因和转座基因具有高度的保守性．酶学实验证明，ND7、ND8、ND9和ND10菌株都具有儿茶酚1，2-双加氧酶活力和儿萘酚2，3-双加氧酶活力，但在不同菌株中这两种酶的比活力有明显不同．

1株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)1217石油降解特性及相关基因分析（英文）

从石油污染土壤中分离得到1株石油降解菌1217,经细菌形态学、生理生化及16S rD NA序列分析初步鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在温度5~65℃,pH 2~10,盐度0~9%的条件下菌株能很好生长,在以正十二烷、正十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘为唯一碳源的培养基中生长良好。在10℃和30℃条件下培养7 d,对原油的降解率分别为21.57%和15.15%。菌株产生的生物表面活性剂可以将表面张力从72.20 mN/m降至35.14 mN/m。利用特异性PCR扩增,在菌株中检测到烷烃单加氧酶、甲苯双加氧酶、联苯双加氧酶、芳香烃双加氧酶和氧化还原酶基因,并成功克隆出烷烃单加氧酶和芳烃双加氧酶基因,同相关基因比对分析,与铜绿假单胞菌PAO1的相应基因相似度分别为99.91%和99.22%。研究表明,菌株在生物修复和石油烃污染环境中具有潜在的应用价值。

Cupriavidus campinensis BJ71菌株2,4-D降解基因tfdA生物信息学分析

本文以2,4-二氯苯氧乙酸高效降解菌Cupriavidus campinensis BJ71菌株中克隆的tfdA基因全序列为研究对象,利用生物信息学方法分析该基因及其推测出的编码蛋白理化性质、蛋白的亲水性或疏水性及亚细胞定位、预测信号肽、跨膜结构域、蛋白二级结构及模体、三级结构等特性。结果表明,BJ71菌株的tfdA基因开放阅读框全长864 bp,系统发育树表明其属于Ⅰ族tfdA基因。TfdA蛋白包含287个氨基酸,分子量为32 kD、理论等电点为6.01,是一种不含信号肽、定位于细胞质中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲是该蛋白主要的二级结构元件。用RaptorX进行三级结构建模、Ramachandran评估显示获得了合理可靠的TfdA蛋白结构模型。

一株深海热液环境来源的PAHs降解菌TVG9-Ⅶ的系统发育与降解基因

【目的】对一株深海热液环境来源的多环芳烃(PAHs)降解菌进行系统发育分析并对其降解特性和降解机制进行研究。【方法】对16S rRNA基因进行扩增和测序,进行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析;利用GC-MS测定其对PAHs的降解率;通过构建基因组Fosmid文库,克隆PAHs降解基因簇;并利用RT-PCR和qPCR研究关键降解酶基因在不同PAHs诱导下的表达情况。【结果】从西南太平洋劳盆地热液沉积物中分离到一株PAHs降解菌株TVG9-Ⅶ,系统发育分析结果表明,该菌株属于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium),与该属的Novosphingobium indicum H25T系统发育关系最为密切,它们的16S rRNA基因序列相似性高达99.7%。该菌株在21 d内对菲、荧蒽和芘的降解率分别为95.2%,57.3%和69.6%。从Fosmid文库中筛选得到一个负责PAHs降解的上游基因簇,包含了PAHs起始降解双加氧酶大小亚基(pheA1a/b)基因和一个脱氢酶基因;RT-PCR和qPCR实验表明,双加氧酶大亚基基因pheA1a在菲的诱导下上调表达4.2倍,而在萘及高环荧蒽和芘的诱导下无上调。【结论】菌株TVG9-Ⅶ是Novosphingobium属深海热液来源的PAHs降解菌,具有良好的降解特性,特别是对高环PAHs的降解效果较好。

基于1983—2019年文献计量对多环芳烃降解基因研究及进展的剖析

为全面、系统地了解1983—2019年37年间多环芳烃降解基因研究领域的发文趋势、主要的研究国家和机构、研究热点及其变化趋势等,本文以Web of Science核心数据库为数据源,利用文献计量学方法对此进行分析,结果表明:①全球对多环芳烃降解基因研究的重视程度越来越高,而且分子生物学的技术手段在该研究领域中得到了广泛应用,发文主要集中于微生物学、生物技术与应用微生物学、环境科学等3个学科;②美国、中国、日本、德国等国家发文较多,相比其他国家,中国需进一步加强与其他研究机构间的交流合作;③1983—1995年该研究领域侧重于高效降解菌的筛选及其特性研究,1996—2019年则大规模展开了对其降解途径多样性的研究,近年来更侧重于运用多种生物信息技术来研究多环芳烃的代谢机理及构建生物降解调节机制;④目前已报道了nah、phd、nag、phn、nar和nid等6类多环芳烃降解菌的功能基因,为污染场地的生物修复提供了相应支撑.