应用限制性酶切位点相关DNA测序技术(RAD-seq)检测白洋淀和微山湖野生莲多样性

采集莲(Nelumbo Adans.)样本共127份,其中:白洋淀野生莲居群样本60份、微山湖居群样本45份、对照样本共22份(黑龙江、吉林、辽宁、内蒙、湖南、四川野生莲样本6份,古代莲样本4份,莲栽培品种样本5份,泰国、印度、越南、澳大利亚的野生莲样本5份,美洲莲、亚美杂交莲样本各1份)。采用限制性酶切位点相关DNA测序技术(RAD-seq)对莲样本单核苷酸多态性(SNP)检测、遗传多样性和遗传结构分析。结果表明:对116份莲样本简化测序,共得到高质量序列数919915896条、高质量碱基数据128055038010 bp。经单核苷酸多态性检测,共得到535269个单核苷酸多态性标记,构建了邻接法(NJ)系统发育树和群体遗传结构图;系统发育树表明,所有莲样本可分为10个分支,其中48份白洋淀野生莲样本、36份微山湖野生莲样本、6份中国其他地区野生莲样本、4份古代莲样本,泰国、印度等外国野生莲样本共同组成1个伞状分支。遗传结构分析表明,白洋淀和微山湖野生莲居群主体属于同一遗传背景,与系统发育树反映的结果高度一致。说明在大地理范围的外国野生莲作为对照的背景下,白洋淀野生莲居群和微山湖野生莲居群之间未呈现显著遗传分化。

一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性(RSAP)的建立与优化

了避开基于限制性酶切位点分子标记技术的DNA酶切环节，简化其复杂的程序，试验以辣椒为材料，建立了一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性（RSAP），并对其反应体系进行了优化，对RSAP适用性、重复性进行了检验。结果显示，RSAP技术的引物为2条长度均为18bp的引物，引物的3’端为4～6个碱基的限制性酶切位点序列，接着是12～14个碱基的随机序列，2条引物的限制性位点和随机序列不同；PCR扩增的前5个循环采用35C的退火温度，随后的35个循环采用48℃的退火温度；在25μL反应体系中，模板DNA用量为20ng，Mg^2＋浓度为2．5mmol／L，dNTPs浓度为0．2mmol／L，TaqDNA聚合酶用量为1．5U，2条引物浓度均为600nmol／L;RSAP技术重复性好，适用性广泛，是一种操作简便、产率中等、稳定可靠的DNA标记技术。

用于海南坡鹿遗传多样性研究的多态性微卫星DNA标记(英文)

海南坡鹿(Cervus eldi hainanus)是坡鹿的一个亚种,仅分布于中国海南岛,该种群在二十世纪七十年代经历了严重的瓶颈效应。为了解该物种的遗传多样性及亲缘关系,本文从牛科及其它鹿科的已报道的104对微卫星位点中筛选了10对保守性好、多态性较高的微卫星位点。这10对微卫星位点的期望杂合度范围为0·042到0·640 ,等位基因数为2至6 ,因此是多态性较好的微卫星位点,不仅可用于检测海南坡鹿的遗传多样性,同时还可以适用于其它偶蹄目动物的相关研究[动物学报51 (3) : 530 -534 , 2005]。

RAD标记测序及其在分子育种中的应用

基于限制位点相关的DNA(restriction site associated DNA,RAD)标记的测序方法是一种新型的测序技术.其优点是不仅节省传统测序的试验成本,而且能快速准确的定位出数以千计的基因标记,从而更加适合分子辅助育种的应用.该方法可应用于寻找DNA多态性,鉴别SNP,构建未知基因组序列生物的遗传图谱,定位目的性状基因等.本文主要综述了RAD标记和RAD测序的研究进展及其在分子育种中的应用.

基于限制位点相关的DNA(RAD)测序技术检测甜菜多态性

甜菜是一种重要的糖料作物,占世界糖来源的1/3。甜菜品种改良的主要障碍是其遗传变异小、遗传资源有限。在本研究中,我们使用限制性位点相关DNA (restriction-site-associated DNA, RAD)测序技术,在全基因组范围内搜寻20种甜菜基因型的SNPs和SSRs。根据有效限制性酶切片段(restriction fragment, RF)的GO注释,发现7 144个与"生物过程"有关,4 378个与"细胞组份"有关,3 763个与"分子功能"有关。采用多重比对方法,鉴定出甜菜含有38 884 682 SNP位点。这些SNP成功地揭示了甜菜基因型间的遗传关系。此外,在RAD酶切序列中也鉴定出了17 916个SSR位点。甜菜基因组中最常见的SSR序列为二核苷酸(6 019, 33.60%),其次是单核苷酸4 321 (24.11%),再次是三核苷酸3 597 (20.07%)。RAD测序技术使甜菜分子标记的快速全基因组发现成为可能。本研究所鉴定的大量SNP和SSRs位点,对构建甜菜高密度遗传连锁图谱、QTL分析、标记辅助选择和比较研究具有重要意义。

日本鳗鲡离散SNP标记筛选及群体遗传多样性分析

日本鳗鲡(Anguilla japonica)野生资源数量锐减,亟需对其开展群体遗传学和保护遗传学研究。单核苷酸多态性标记(SNP)是重要的遗传标记,然而在日本鳗鲡中还尚未有报道。本研究采用酶切位点相关DNA测序技术开发了日本鳗鲡的离散SNP标记,利用KASPar技术对辽宁丹东和福建三沙两个群体共61尾玻璃鳗样品进行SNP分型,验证所开发SNP标记的多态性。研究共得到38个多态性较高的离散SNP标记。在丹东群体中,这38个位点的观测杂合度(Ho)为0.000~0.407,期望杂合度(He)为0.033~0.484;在三沙群体中,这38个位点的观测杂合度(Ho)为0.032~0.500,期望杂合度(He)为0.032~0.494。这表明已处于濒危状态的日本鳗鲡依然具有较高的遗传多样性水平。丹东群体中的AJ_SNP_03位点和三沙群体中的AJ_SNP_25和AJ_SNP_35位点偏离哈温平衡,所有位点间均不存在连锁不平衡现象。丹东群体和三沙群体间的遗传距离FST值为-0.005(P=0.898),表明这两个群体间无显著的遗传分化,符合日本鳗鲡随机交配的属性。研究结果表明,本研究开发的SNP标记可以用于解析日本鳗鲡的群体遗传结构及探究其本地适应性,为其资源的保护提供基础资料。

异型花多态性微卫星标记的开发

异型花是青藏高原特有的一年生草本植物。为了更好地利用和保护这一重要的植物资源,本研究开发了异型花的多态性微卫星标记。首先,基于限制性位点相关DNA测序(RAD-seq)技术,开发了异型花14个多态性微卫星位点和2个单态性微卫星位点的引物;随后,对异型花的3个自然居群的57个个体的14个位点进行了分析。结果显示:14个位点观察到的等位基因数为4~7个,平均为5.071个;期望杂合度范围为0.003~0.312 (平均值为0.194),而观测杂合度范围为0~0.281 (平均值为0.047)。其中,仅有3对引物在龙胆科的椭圆叶花锚中具有通用性。本研究开发的多态标记对研究异型花种群结构和遗传多样性具有重要意义。

基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。

简化基因组测序技术及其在海洋生物研究中的应用

传统开发遗传标记的方法通常会消耗大量的人力、物力和时间,伴随着高通量测序技术的飞速发展,一种高效的标记开发技术即简化基因组测序技术开始得到广泛应用.简化基因组测序技术可以在一次实验中获得成千上万的遗传标记,建库过程简易,成本较低.其通过实验手段降低基因组的复杂度,仅对部分基因组进行测序,随后在该部分获得的基因组开发分子标记.基于酶切的简化基因组测序技术可分为三大类:简化代表库测序、限制性酶切位点相关DNA测序和低覆盖度的分型测序.在海洋生物研究中,简化基因组测序技术已被广泛应用于群体遗传学、系统进化学、适应性进化、遗传图谱构建及数量性状位点定位等研究领域.

泡桐高密度分子遗传图谱的构建

以毛泡桐Paulownia tomentosa为母本、白花泡桐Paulownia fortunei为父本进行正反交,以杂交获得的子一代(F1)构建泡桐连锁图谱的作图群体,选取限制性内切酶EcoRI对185个样品的基因组进行酶切,利用Illumina Hiseq2000测序平台进行RAD测序建库,以白花泡桐基因组为参考,采用SOAP2软件进行序列比对,利用筛选到的单核苷酸多态性SNP(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)位点对该群体进行基因型分析,使用Joinmap version 4.0软件构建泡桐连锁遗传图谱。结果表明:利用RAD测序技术共获得551894个SNP标记,构建了含20个连锁群的泡桐遗传连锁图谱,该图谱的总图距为2050.77cM,标记间平均图距为0.58cM,图谱预期长度为2064.29cM,图谱基因覆盖度为99.35%。本研究构建的泡桐连锁遗传图谱具有高精度和覆盖泡桐基因组完整(构建连锁群数目等于泡桐单倍体基因组染色体的数目)的优点,为泡桐分子育种学研究奠定了基础。

幽门螺杆菌的基因分型技术及其应用

幽门螺杆菌(Hp)可以在人群中广泛传播,并会引发一系列的胃肠道疾病甚至胃癌。不同基因型的Hp感染可能会引发不同类型的疾病,而基因分型技术是研究这类问题的重要方法。本文主要介绍了多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态DNA、扩增片段长度多态性和全基因组测序这五种基因分型技术,通过综述这几种技术在Hp基因分型中的应用进展,比较它们之间的优缺点,为今后研究Hp的致病机制、传播机制以及流行病学调查提供方法学依据。

基因工程

901980 胞内重组克隆酿酒酵母的 LEU2基因[英文]/Valinger,R.…//Arch.Microbiol.-1989,152(3).-263～268[译自 DBA,1989,8(25),89-14743]介绍了一种细胞内构建具有多个限制性位点的大质粒的方法.酿酒酵母的23kb环状自主复制质粒

基因工程

902265 寡核苷酸导向的核酸酶顺序选择性水解 DNA 双螺旋[英]/Corey,D.R.…//J.Am.Chem.Soc.-1989,111(22).-8523～8525[译自 DBA,1990,9(1)。