限制性内切酶介导的粉红粘帚霉67-1转化体系构建

本文将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应时间对转化效率具有显著的影响。当质粒经线性化后加入40%PEG3350和20 U HindⅢ,室温下转化10 min时,转化效率可达到30～40 CFU.μg 1质粒DNA。PDA平板上连续培养3代,再转接到潮霉素抗性平板中,获得遗传稳定的转化子。PCR检测、Southern杂交和Real-time PCR检测等证明hph基因已整合到基因组中,且多为单拷贝插入。对随机挑取的50个转化子生长性状的测定结果表明,20%的转化子在PDA培养基中生长较快,12%的转化子产孢水平较高;另有16%～20%的转化子生长缓慢、产孢量减少;还有4%的转化子生长微弱,且无明显产孢现象。上述方法可以成功用于在粉红粘帚霉中引入外源基因,为今后生防粘帚霉高效工程菌株的构建提供了依据。

限制性内切酶介导的整合技术

限制性内切酶介导的整合技术是近年发展起来的一种研究基因的新方法,与质粒拯救相结合,可快速分离质粒两侧的DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究.该技术已应用于基因突变、基因标记、寻找新基因等研究领域.本文重点介绍了限制性内切酶介导的整合技术的原理、影响因素及应用现状.

利用限制性内切酶技术获得木霉菌插入变异

利用限制性内切酶介导整合(REM I)技术,通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(B otry tis cinerea)效果优于初发菌T richod erm a v irid e T 21菌株(初发菌)的3个变异株T trm 31、T trm 34和T trm 55.变异株本身产生的和诱导番茄植株产生的几丁质酶和-β1,3-葡聚糖酶的活性均比初发菌高,因此,通过REM I技术可以获得新的有益变异株,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平,尤其是提高诱导番茄抗病水平.对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%,说明REM I技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果.

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

为了构建限制性内切酶介导的整合(REMI)技术介导的红曲霉(Monascus anka)遗传转化系统,以潮霉素B作为抗性筛选标记,pBC-Hygro、pCB1003、pAN7-1作为转化质粒,采用REMI技术转化红曲霉。结果表明,用REMI技术介导红曲霉转化时,质粒pBC-Hygro和pCB1003适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别;在用REMI技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化;原生质体浓度为1×107～1×108个/mL时,每微克质粒可获得的潮霉素B抗性转化子为2800～3200个;HindⅢ介导转化时的最佳酶用量为105～120U;在质粒用量为8μg/100μL时转化率最高。

红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响

为研究红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响,丰富洛伐他汀代谢调控机制。用ATMT和REMI法将gus-orf5融合基因转化红曲霉,并对ATMT法的共培养条件和REMI法的内切酶进行优化筛选,对获得的潮霉素抗性菌株进行GUS染色和PCR鉴定,并检测阳性菌株的洛伐他汀含量变化。结果筛选出20μg/mL潮霉素的培养基作为转基因红曲霉的抗性筛选浓度,补充1/10 LB的Co-IM共培养基有利于ATMT法转化,在REMI法中Xba I介导的转化效果较好。用ATMT和REMI法均获得抗性菌落,经PCR检测表明orf5和hyg基因均已导入红曲霉,GUS染色呈蓝色。过表达菌株的洛伐他汀含量比对照明显提高,高达36.89%。红曲霉过表达orf5有利于增加洛伐他汀的积累,为深入研究红曲霉orf5基因的功能提供参考。

脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立

以中性乳糖酶生产菌脆壁克鲁维酵母为材料,构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母,对受体菌生长时期、电场强度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明,以OD600为0.8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压1.5 kV、电场强度为7.5 kV.cm-1、电击后培养时间为90 min,可获得较高的转化率,最高转化效率为2.37×102转化子.μgDNA。在电击转化的同时加入限制性内切酶10μL,对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87.5%的转化子为同源重组,从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。

木霉菌REMI转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理,为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration,REMI),通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55,对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高;木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高,因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果。

高效除藻真菌云芝F21a遗传转化体系的建立

以蓝藻高效降解菌云芝F21a(Trametes versicolor)为出发菌株,对其原生质体的制备、再生条件及限制性内切酶介导的遗传转化进行研究。结果表明:在PDA培养基上,28℃培养4 d的菌丝最适于原生质体制备;0.6 mol/L KCl为最适等渗条件;30℃混合酶液(2%cellulase+2%snailase+2%lywallzyme)酶解4 h,原生质体产量达到2.375×107个/m L,此时再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术可将质粒p AN7-1导入云芝F21a的原生质体,在含有150μg/m L潮霉素的RM培养基中能够获得再生菌株,PCR验证初步表明该质粒已经转入云芝F21a原生质体。连续传代转接显示,阳性转基因菌株外源基因可以稳定表达,本结果为研究真菌高效消除蓝藻的分子机制奠定基础。

木霉菌REMI突变菌株在降解敌敌畏中的作用（英文）

本研究对木霉菌T30野生株和限制性内切酶介导的DNA整合技术(REMI)构建的突变株进行降解敌敌畏能力和最佳条件的研究。结果表明,野生株和几个REMI突变株均能降解有机磷农药敌敌畏,但以突变株TK-3降解活性最高,其降解效率达98%。TK-3突变株降解有机磷农药效率取决于葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH等。突变株降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1 000μg/mL,最适pH为7.0,敌敌畏浓度500μg/mL。敌敌畏浓度超过1 000μg/mL则会抑制木霉菌降解能力。