一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性(RSAP)的建立与优化

了避开基于限制性酶切位点分子标记技术的DNA酶切环节，简化其复杂的程序，试验以辣椒为材料，建立了一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性（RSAP），并对其反应体系进行了优化，对RSAP适用性、重复性进行了检验。结果显示，RSAP技术的引物为2条长度均为18bp的引物，引物的3’端为4～6个碱基的限制性酶切位点序列，接着是12～14个碱基的随机序列，2条引物的限制性位点和随机序列不同；PCR扩增的前5个循环采用35C的退火温度，随后的35个循环采用48℃的退火温度；在25μL反应体系中，模板DNA用量为20ng，Mg^2＋浓度为2．5mmol／L，dNTPs浓度为0．2mmol／L，TaqDNA聚合酶用量为1．5U，2条引物浓度均为600nmol／L;RSAP技术重复性好，适用性广泛，是一种操作简便、产率中等、稳定可靠的DNA标记技术。

大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术及其优化

建立和优化了大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系 (SADF)。分别用限制酶PstI、EcoRI和MseI酶切大麦基因组DNA ,再与各自相应的人工接头连接 ,使用带三个选择碱基的引物进行选择性扩增。结果表明 :采用分别优化建立的标准PCR扩增检测体系 ,六个识别碱基的PstI和EcoRI的SADF均能得到丰富稳定的带形 ,四个识别碱基的MseI不能得到明显谱带。SADF扩增产物片段大小范围为 :PstI一般在 2 0 0～ 2 0 0 0bp ,而EcoRI在 2 0 0～ 10 0 0bp ;两者在不同大麦品种中均能检测到多态性 ,可用于不同大麦品种的检测 ,但PstI得到的带型明显优于EcoRI,在大麦中得到的片段具有范围宽、分布均匀、易于观察、多态性高等特点。

草鱼基因组随机扩增多态性引物及多态性位点的筛选

为了建立草鱼基因组DNA多态性分析的指标体系,应用RAPD技术,从180条10碱基随机引物中筛选出了31条能扩增出多态性DNA片段的引物。用这31条多态性引物共扩增出了327条重复性好、带型清晰、分辨率高的谱带。扩增产物的片段大小范围在400—2000 bp之间。单一引物扩增条带为5—14条。用这些多态性引物在草鱼基因组DNA中检测到了93个多态性位点,并对这些多态性位点上的等位基因频率进行了统计分析。这31条多态性引物和所检测到的93个多态性位点初步为草鱼基因组的多态性分析提供了可靠的分析指标体系。

野大豆群体DNA随机扩增产物的限制性内切酶消化

为了提高ＲＡＰＤ方法检测野大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｓｏｊａＬ．）群体ＤＮＡ多态性的能力，随机扩增产物用限制性内切酶（ＭｓｐⅠ、ＨｉｎｆⅠ、ＴａｑⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＳａｌⅠ、ＤｒａⅠ和ＨａｅⅢ）消化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后用银染法检测酶切产物，结果发现：１．有的限制性内切酶能够消化野大豆群体ＤＮＡ的随机扩增产物，有的却不能。２．有的限制性内切酶消化无ＲＡＰＤ个体的扩增产物后能够产生多态性ＤＮＡ片段，有的内切酶不能产生。３．有的引物的无ＲＡＰＤ个体的扩增产物经限制性内切酶消化后能够产生多态性的ＤＮＡ片段；有的引物的扩增产物虽然可被内切酶消化，但不能够产生多态性ＤＮＡ片段。实验证明，用限制性内切酶消化扩增产物，确实能够提高ＲＡＰＤ方法检测野大豆群体ＤＮＡ多态性的能力。

中国部分地区绵羊肺炎支原体的基因多态性分析

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在我国部分地区的流行病学特征,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)及限制性片段长度多态性(RFLP)方法对26株Mo基因多态性进行了研究,并利用NTsys-2.10e软件对获得的多态性图谱进行了聚类分析。结果在相似系数为0.70时,26株Mo可分成6个RAPD群或6个RFLP群;相似系数为0.90时,分成18个RAPD群或18个RFLP群;相似系数为1.00时,分成25个RAPD群或26个RFLP群。结果表明,我国Mo存在高度的基因多态性,这种多态性与地域差异相关,与宿主来源也具有一定的相关性。研究结果为了解我国Mo的分子流行病学特征打下了基础,也为建立有效的Mo诊断方法和疫苗研制提供了参考依据。

基于RSAP标记的10个白杨派无性系指纹图谱构建及遗传分析

【目的】评判限制性位点扩增多态性(RSAP)标记对杨树无性系良种的鉴定效果,为杨树种质资源保护与品系鉴定提供依据。【方法】以白杨派10个优良无性系(秦白杨1号、秦白杨3号、秦白杨5号、84K、I-101、新疆杨、毛白杨30号、07-17-18、07-23-23、07-30-11)为材料,从9条RSAP引物组成的36对引物组合中筛选出6对扩增效果较好的引物组合,利用毛细管电泳检测法及POPGENE 32软件检测并分析扩增产物多态性,计算遗传多样性相关指标;选取多态性高且能区分所有无性系的引物,构建白杨派10个无性系的指纹图谱;利用NTSYS 2.1软件计算各无性系间的遗传相似系数,基于UPGMA进行聚类分析。【结果】6对引物组合从10个白杨派无性系中共扩增多态位点133个,平均每对引物扩增22.17个,平均Shannon信息指数为0.326,平均Nei’s基因多样性指数为0.488,表明无性系间具有较高的遗传多样性,遗传变异丰富。利用2个引物组合Rs2/Rs4和Rs2/Rs7的6个多态性位点,即可将10个白杨派无性系全部鉴别开来。10个白杨派无性系间的遗传相似系数为0.400~0.817,平均遗传相似系数为0.594。聚类结果显示,在遗传相似系数0.510处,10个白杨派无性系被分成两大类,新疆杨和毛白杨30号聚为一类,其余无性系聚为另一类,与其实际亲缘关系大致相符。【结论】RSAP分子标记可有效用于杨树种质资源鉴定及遗传分析,运用毛细管电泳检测可准确定位多态位点,一定程度上弥补了传统聚丙烯酰胺凝胶电泳的缺点。

格尔德霉素(GDA)能导致小麦基因组DNA多态性和甲基化修饰增加

刚露白的普通小麦(Triticum aestivum L.)种子用150μmol/L格尔德霉素溶液处理后,小麦根的生长受到抑制。随机扩增多态性DNA标记技术和双限制性内切酶酶切-随机扩增法检测显示,小麦根端分生细胞基因组DNA的多态性和甲基化比例均增加。本研究从分子生物学和表观遗传学水平探讨了格尔德霉素抑制小麦生长的机制。

扩增片段长度多态（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一种十分理想的分子标记技术

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）标记技术是Zabean和Vos等科学家发展起来的一种新的分子标记技术。于1993年获得欧洲专利局专利。它是继限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）之后的第三代标记技术。

黑龙江省稻瘟病菌遗传多样性研究

利用8个代表性菌株从153对引物组合中筛选出多态性高且稳定性好的10对引物组合,对来自黑龙江省各水稻主要产区的214个稻瘟病菌菌株进行RSAP(Restriction site amplified polymorphism)分析,得到134条多态性条带,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到196个不同单元型(带型)的代表性菌株的指纹图谱。用UPGMA进行聚类分析,以相似系数0.83为界,将214个菌株196个单元型划分为10个遗传宗谱,10个遗传宗谱在黑龙江省的分布存在明显地域差异。

黄颡鱼遗传图谱构建及生长相关性状的QTL定位

以野生(♂)和人工养殖(♀)黄颡鱼杂交的100个F1个体为作图群体,用SSR、SRAP和TRAP3种DNA分子标记技术构建黄颡鱼的遗传连锁图谱。图谱整合了13个SSR标记,89个SRAP标记,26个TRAP标记。其中雌性框架图谱包括16个连锁群,图谱的长度为585.5cM;雄性框架图谱包括15个连锁群,图谱的长度为752.3cM;共享框架图谱包括5个连锁群,图谱的长度为231.3cM。用该连锁图谱对黄颡鱼的5个生长相关性状进行QTL扫描,在雌性图谱上检测到1个头宽的QTL,定位于第七连锁群上,LOD值为3.2,可解释的表型变异为13%。在雄性图谱上分别检测到1个体高和体长的QTL,均定位于第一连锁群上。体高QTL的LOD值为2.4,可解释的表型变异为12%。全长QTL的LOD值为2.1,可解释的表型变异为11%。3个QTL均可用于黄颡鱼的生长性状的标记辅助育种。

RSAP分子标记技术在园艺植物研究中的应用

限制性位点扩增多态性(RSAP)是一种基于PCR的新型植物分子标记技术,具有操作简便、结果稳定、效率较高的特点。该技术以植物基因组上广泛分布的限制性位点位为靶标,通过独特的引物设计和PCR扩增程序,无需限制性酶切环节,只要一个简单的PCR,即可产生基于植物限制性位点的多态性标记。阐述了RSAP的原理与流程,对该技术的优势和应用情况做了总结,并对其前景进行了展望。

RSAP标记技术新引物设计及其反应体系的优化

【目的】对限制性位点扩增多态性（Restriction site amplified polymorphism，RsAP）标记技术进行改进，并优化了其反应体系。【方法】遵循引物设计原则，使限制性位点序列位于中间，在其3’端增加3个选择性碱基，5’端设计为10～12个碱基的随机序列，设计了14条长为19bp的限制性位点扩增多态性（RSAP）新引物。以大白菜、紫菜薹自交系及其F1、F2的DNA为模板，对新引物的反应体系进行了优化，并对其重复性和适用性进行了检验。【结果】新设计引物PCR扩增的前5个循环退火温度为35℃，后35个循环为52℃；在25μL优化反应体系中，模板DNA用量为2．0μL（20．0ng／μL）、Mg^3＋ 3．0μL（25mmol／L）、Taq酶（5U／μL）1．5U、dNTPs2．0μL（2．5mmol／L）、引物各0．6μL（10μmol／L）；新引物扩增出的谱带较原引物更多，多态性更好；只改变选择性碱基，新设计引物就能扩增出新的谱带；新设计引物的重复性、稳定性好，在荞麦和小麦品系，以及紫菜薹、大白菜及其F1、F2中，新引物均能扩增出清晰谱带。【结论】新引物适用性和重复性好，可广泛应用于其他作物的基因组DNA分析。

军曹鱼的分子遗传特性研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)和线粒体DNA(mtDNA)的限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法对广东湛江近海军曹鱼 Rachycentron canadum 的分子遗传学特征进行了研究。RAPD研究结果显示 17 个引物共检测到 119 个位点,其中多态位点比例 P 为80.85%,遗传相似系数S为 0. 740 0,遗传距离 D 为 0. 260 0, Nei 基因多样性指数 H 为0.300 9,Shannon信息指数I为0.449 8。结果表明,军曹鱼的遗传多样性比较丰富。用 19种识别5、6碱基的限制性内切酶对军曹鱼的mtDNA RFLP进行了分析研究,构建其mtDNA物理图谱;用引物 5’ GTG ATC TGA AAA ACC ACC GTT G 3’和 5’ AAT AGG AAGTAT CAT TGC GGT TTG ATG 3’扩增线粒体细胞色素b区段,得到稳定的850bp大小的特异性条带,用18种识别4—6碱基的限制性内切酶对扩增片段的限制性长度多态性进行分析,并测定其序列。

山茶科3种中国特有濒危植物的遗传多样性研究

猪血木(Euryodendronexcelsum)、圆籽荷(Apterospermaoblata)和杜鹃红山茶 (Camelliachangii)均为我国特有的山茶科珍稀濒危植物。本研究应用随机扩增多态性DNA(RAPD)检测方法,比较了这 3个物种的遗传多样性。利用 20-24个随机引物从猪血木、圆籽荷和杜鹃红山茶居群中分别获得 206-305条RAPD谱带,多态位点百分率(PPL)分别为 51. 80%、80. 26%和 38. 83%;居群间遗传分化指数GST分别为 0. 3566、0. 1713、0. 1242。结果显示:自然分布较广的圆籽荷的遗传多样性高于另外两种自然分布区狭窄的种类。3个物种的遗传变异均主要存在于居群内,但猪血木居群间的遗传分化明显高于圆籽荷和杜鹃红山茶,这可能与其生境的严重片断化有关。根据 3个物种不同的遗传结构特点,建议加强现有自然居群的就地保护,促进居群自然更新;收集不同分布点的种源,尽快建立广东山茶科珍稀濒危植物的保育中心,深入开展人工快繁研究,扩大这些种群的数量。

红花檵木花叶芽变的表型分析与RSAP分析鉴定

为从表型和分子水平上区分红花檵木芽变类型与普通类型,以＂密枝玫红＂及其3份花叶芽变为材料,在分析其表型特征和观察物候期的基础上,结合限制性位点扩增多态性技术,对其遗传稳定性进行了初步研究。结果表明：＂密枝玫红＂花叶芽变与母株的主要表型差异表现在叶片长度和枝梢长度方面,其它表型特征差异不显著,3份花叶芽变的主要物候期均早于母株红花檵木;4份材料的组织浸提液经黄豆、黄瓜、辣椒、番茄和红花檵木生物接种试验检测无病毒感染症状,其扦插苗后代表型稳定;从45对引物组合中筛选了13对引物进行PCR扩增,共产生了1 174条带,在芽变单株及其母株之间产生了146条差异条带,条带主要集中在100-2 000 bp之间;＂密枝玫红＂花叶芽变是一类不同于母株的芽变新种质。

秦岭细鳞鲑黑河种群和湑水河种群的遗传多样性分析

采用RAPD技术对秦岭细鳞鲑Brachymystax lenok黑河种群和湑水河种群的遗传多样性进行分析,以科学地评价其种群遗传结构。结果表明,黑河种群的多态位点比例(P)为25.8%,种群平均杂合度(H)为0.1782,Shannon多样性指数(H0)为0.6520;湑水河种群的P为23.4%,H为0.1526,H0为0.05214。黑河种群内各个体之间的遗传相似度(F)为0.9495,遗传距离(d)为0.0664;湑水河种群内各个体之间的F为0.9549,d为0.0556;2个群体之间的遗传距离(D)为0.0152。分析结论是2个种群具有较低的遗传多样性。

翘嘴红鲌群体遗传多样性分析

基于RAPD方法对江西（鄱阳湖）、湖北（梁子湖）和江苏（太湖）3个群体的翘嘴红鲌遗传多样性进行分析,以评价它们的群体遗传结构和良种选育的可行性。结果显示从30个随机引物中筛选出了20个多态性较高的引物,既可扩增出3个群体共同的DNA条带,也可扩增出单个群体特有的特征条带。从3个群体实验鱼中共检测到119个扩增片段,长度在0.2-1.7kb之间。鄱阳湖群体多态位点数61个,多态位点比为51.26%,梁子湖群体多态位点数50个,多态位点比为42.02%,太湖群体多态位点数67个,多态位点比为56.30%。3个群体的Shannon多样性指数分别为0.429 2,0.382 8和0.443 1。群体间遗传相似系数依次为：最高是鄱阳湖与梁子湖,为0.8055,其次是鄱阳湖与太湖,为0.801 6,最低是梁子湖与太湖,为0.785 2。结果提示,鄱阳湖与梁子湖亲源关系较近,与太湖稍远;所筛选出的引物应用RAPD技术可以方便地分析不同群体翘嘴红鲌的遗传多样性,并可为良种选育的亲本选择提供依据。

翘嘴红鲌苏州和宜兴养殖种群的遗传多样性分析

目的:对翘嘴红鲌养殖种群遗传多样性进行分析,以科学地评价它们的种群遗传结构。方法:采用RAPD技术,对翘嘴红鲌苏州和宜兴养殖种群的遗传多样性进行分析。结果:苏州养殖种群的多态位点比例为25%,种群平均杂合度为0.1654,Shannon多样性指数为0.671;宜兴群体的多态位点比例为22.4%,群体平均杂合度为0.1446,Shannon多样性指数为0.0594。苏州群体内各个体之间的遗传相似度度为0.9378,遗传距离为0.0622;宜兴群体内各个体之间的遗传相似度度为0.9444,遗传距离为0.0556;两群体之间的遗传距离为0.0146。结论:两种群具有较低的遗传多样性。

贵州省加工型辣椒资源RSAP分析

利用RSAP标记技术对贵州省的20份加工型辣椒种质资源进行评价,以期为辣椒品种选育提供依据。结果表明,3对引物共扩增出72条带,其中47条为多态性条带,多态性比例为65.3%,平均每对引物产生24条多态性条带,片段大小为100～2 000bp。聚类分析结果表明,20份材料的遗传相似系数变化范围为0.625～0.931,果形性状在聚类图中呈随机分布,表明贵州省加工型辣椒种质间存在着丰富的遗传多样性。

婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。