利用限制性内切酶诱导整合(REMI)获得稻瘟病菌突变体

限制性内切酶诱导整合（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＥｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，简称ＲＥＭＩ，下同）已被成功用于创造随机插入突变和提高转化频率。用限制酶消化的线状质粒ｐＣＳＮ４３或ｐＢＦ１０１，并加一定量的同种限制酶，转化稻瘟病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）的原生质体后，得到约４５０个转化子。对一些表型进行测试后，获得两个分生孢子形态突变体。与野生型相比较，突变体的分生孢子细而且长，呈棒形。ＲＥＭＩ非常有用，因其能提高转化频率，较容易地获得期望数目的转化子；限制性内切酶可随机切割寄主染色体，便于插入线状质粒，导致基因突变。可根据异常表型判定基因的功能，根据插入质粒克隆该基因。

限制性内切酶介导的整合技术

限制性内切酶介导的整合技术是近年发展起来的一种研究基因的新方法,与质粒拯救相结合,可快速分离质粒两侧的DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究.该技术已应用于基因突变、基因标记、寻找新基因等研究领域.本文重点介绍了限制性内切酶介导的整合技术的原理、影响因素及应用现状.

稻瘟病菌限制酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变

应用提高真菌转化率的技术———限制酶介导整合 (restrictionenzymemediatedintegration ,REMI)技术转化稻瘟病菌株Magnaporthegrisea131原生质体 ,在限制酶HindIII,KpnI或SacI介导下转化效率分别提高 6 .5、10、3.7倍 .通过 30 0 μg/mL潮霉素筛选获得 10 0 0个以上转化子 .用突变体接种水稻鉴别品种 ,发现其中M2 5和M36与M131比较其致病性发生了改变 .另外还发现产孢缺陷型突变体和培养性状发生改变的突变菌株 .rep

限制性内切酶介导的粉红粘帚霉67-1转化体系构建

本文将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应时间对转化效率具有显著的影响。当质粒经线性化后加入40%PEG3350和20 U HindⅢ,室温下转化10 min时,转化效率可达到30～40 CFU.μg 1质粒DNA。PDA平板上连续培养3代,再转接到潮霉素抗性平板中,获得遗传稳定的转化子。PCR检测、Southern杂交和Real-time PCR检测等证明hph基因已整合到基因组中,且多为单拷贝插入。对随机挑取的50个转化子生长性状的测定结果表明,20%的转化子在PDA培养基中生长较快,12%的转化子产孢水平较高;另有16%～20%的转化子生长缓慢、产孢量减少;还有4%的转化子生长微弱,且无明显产孢现象。上述方法可以成功用于在粉红粘帚霉中引入外源基因,为今后生防粘帚霉高效工程菌株的构建提供了依据。

利用限制性内切酶技术获得木霉菌插入变异

利用限制性内切酶介导整合(REM I)技术,通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(B otry tis cinerea)效果优于初发菌T richod erm a v irid e T 21菌株(初发菌)的3个变异株T trm 31、T trm 34和T trm 55.变异株本身产生的和诱导番茄植株产生的几丁质酶和-β1,3-葡聚糖酶的活性均比初发菌高,因此,通过REM I技术可以获得新的有益变异株,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平,尤其是提高诱导番茄抗病水平.对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%,说明REM I技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果.

限制酶介导整合技术:一种克隆新基因的新策略

限制酶介导整合(REMI)技术是近年发展起来的一种研究新基因的方法,已被用于盘基网柄菌、酵母和丝状真菌等微生物细胞与发育过程的研究。结合质粒拯救技术,可快速分离质粒两侧未知的基因组DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究。我们简要介绍了REMI技术的基本原理、影响因素、缺点及其应用。

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

为了构建限制性内切酶介导的整合(REMI)技术介导的红曲霉(Monascus anka)遗传转化系统,以潮霉素B作为抗性筛选标记,pBC-Hygro、pCB1003、pAN7-1作为转化质粒,采用REMI技术转化红曲霉。结果表明,用REMI技术介导红曲霉转化时,质粒pBC-Hygro和pCB1003适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别;在用REMI技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化;原生质体浓度为1×107～1×108个/mL时,每微克质粒可获得的潮霉素B抗性转化子为2800～3200个;HindⅢ介导转化时的最佳酶用量为105～120U;在质粒用量为8μg/100μL时转化率最高。

木霉菌REMI转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理,为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration,REMI),通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55,对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高;木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高,因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果。

无辅助病毒HSV-1载体介导LacZ基因在培养皮层神经元中的表达

目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype 1,HSV 1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题。方法:将一组含HSV 1基因组的粘粒以限制性内切酶PacⅠ酶切、纯化后,与含LacZ和酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase,TH)及神经微丝(neurofilament,NF)嵌合启动子的HSV 1质粒DNA在脂质体作用下,共转染 2 2细胞;在 34℃条件下培养 72h,收获病毒颗粒。将含病毒颗粒的上清液,加入BHK细胞培养液中,继续培养 24h后,加X gal染液作用 4h,观察表达LacZ基因的蓝染细胞。取培养第 3天的胚胎大鼠大脑皮层神经元,加入含病毒颗粒的培养液,过夜后更换新鲜培养液,分组继续培养 1, 7和 14d,进行X gal染色,光镜下观察。结果:包装形成的病毒颗粒感染BHK细胞, 24h后可见表达LacZ基因的蓝染细胞;感染培养第 3天的皮层神经元,继续培养 1, 7和 14d后均可见蓝染神经元。结论:无辅助病毒包装系统能够使含TH NF嵌合启动子的HSV 1载体形成有效的病毒颗粒,并且在体外培养神经元中持续稳定地表达外源基因,为在神经系统进行基因转移和基因功能研究提供了有效的工具。

脂质体介导外源性基因在骨髓基质细胞表达

目的:用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞,并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法:构建的重组载体鉴定后,以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率;转染后48h进行细胞免疫组化染色检测目的基因的表达情况。结果:限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX 1基因;克隆的目的片断经序列测定与GenBank公布的序列一致;质粒∶脂质体为1∶1或1∶2的转染效率最佳;细胞免疫化学染色检测证实转染后骨髓基质细胞有PDX 1基因表达。结论:成功构建了含有PDX 1基因的真核表达载体;通过优化转染条件提高了pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞的效率,为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。

稻瘟菌REMI突变体库的构建

以稻瘟病菌菌株P131和Y34为材料,利用REMI技术构建了含有8000个转化体的突变体库.对REMI转化的部分条件进行了优化,比较了不同限制性内切酶(XhoI、ApaI和EcoRV)之间REMI转化效率的差异.结果表明,稻瘟菌分生孢子在摇培32h和Driselase消化菌丝2h或3h时较适宜REMI转化;XhoI和ApaI之间没有明显差异,而两者的转化率高于EcoRV.

木霉菌REMI突变菌株在降解敌敌畏中的作用（英文）

本研究对木霉菌T30野生株和限制性内切酶介导的DNA整合技术(REMI)构建的突变株进行降解敌敌畏能力和最佳条件的研究。结果表明,野生株和几个REMI突变株均能降解有机磷农药敌敌畏,但以突变株TK-3降解活性最高,其降解效率达98%。TK-3突变株降解有机磷农药效率取决于葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH等。突变株降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1 000μg/mL,最适pH为7.0,敌敌畏浓度500μg/mL。敌敌畏浓度超过1 000μg/mL则会抑制木霉菌降解能力。

不动杆菌中整合子及其与耐药性的关系研究

目的了解不动杆菌属中的整合子及其与耐药性的关系。方法采用多重聚合酶链反应(PCR)检测整合子;采用ERIC-PCR检测其同源性;用联合限制性片段多态性分析检测整合子基因盒。结果 122株不动杆菌中53株包含有1类整合子,而这53株中只有40株扩增出耐药基因盒,其有4种基因盒:arr-3-aacA4(几种不同的菌株中的24株)、aacC1-orfP-orfQ-aadA1a(11株,可能所有是相同的菌株)、aacA4-catB8-aadA1(2株)和dfrⅦ(1株)。结论整合子和耐碳青霉烯类缺少相关性;我国的整合子基因盒出现地域化,而arr3基因我国成为一个特征;arr3-aacA4基因盒在不动杆菌菌株中存在明显的水平基因转移,说明整合子基因盒在不动杆菌中存在明显的水平基因转移。

红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响

为研究红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响,丰富洛伐他汀代谢调控机制。用ATMT和REMI法将gus-orf5融合基因转化红曲霉,并对ATMT法的共培养条件和REMI法的内切酶进行优化筛选,对获得的潮霉素抗性菌株进行GUS染色和PCR鉴定,并检测阳性菌株的洛伐他汀含量变化。结果筛选出20μg/mL潮霉素的培养基作为转基因红曲霉的抗性筛选浓度,补充1/10 LB的Co-IM共培养基有利于ATMT法转化,在REMI法中Xba I介导的转化效果较好。用ATMT和REMI法均获得抗性菌落,经PCR检测表明orf5和hyg基因均已导入红曲霉,GUS染色呈蓝色。过表达菌株的洛伐他汀含量比对照明显提高,高达36.89%。红曲霉过表达orf5有利于增加洛伐他汀的积累,为深入研究红曲霉orf5基因的功能提供参考。

三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法建立及应用

目的 建立一种筛选第一、二和三类整合酶基因 (intⅠ )的简并引物PCR方法 ,并对临床菌株进行整合子筛选和分类。方法 用梯度PCR方法确定PCR反应的最适退火温度 ,并对 1 6株临床标本进行PCR扩增 ,通过对阳性PCR扩增产物的限制性内切酶分析进行整合子分类。结果 根据梯度PCR结果确定最适退火温度为 4 6℃。应用简并引物PCR法检测 1 6株临床分离株 ,其中 8株阳性 ,经酶切分类后确定其中 4株只含有第一类整合酶基因 ,有 3株含有第二类整合酶基因 ,1株同时含有第一类和第二类整合酶基因。结论 建立了一种同时筛选第一、二和三类整合子的方法 ,实际检测显示其可行性 ,为全面细致研究整合子介导的细菌耐药提供了一种快速、简便的方法。

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物.针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤:首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端)酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的 构建人血管内皮生长因子(VEGF- C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF- C的生物学功能奠定基础。方法 根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF- C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5 His TOPO载体中。采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达。结论 经RT -PCR扩增转染细胞cDNA和Westernblotting检测证实重组质粒pcDNA3.1 VEGF- C能在宿主细胞中高效表达。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

高效除藻真菌云芝F21a遗传转化体系的建立

以蓝藻高效降解菌云芝F21a(Trametes versicolor)为出发菌株,对其原生质体的制备、再生条件及限制性内切酶介导的遗传转化进行研究。结果表明:在PDA培养基上,28℃培养4 d的菌丝最适于原生质体制备;0.6 mol/L KCl为最适等渗条件;30℃混合酶液(2%cellulase+2%snailase+2%lywallzyme)酶解4 h,原生质体产量达到2.375×107个/m L,此时再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术可将质粒p AN7-1导入云芝F21a的原生质体,在含有150μg/m L潮霉素的RM培养基中能够获得再生菌株,PCR验证初步表明该质粒已经转入云芝F21a原生质体。连续传代转接显示,阳性转基因菌株外源基因可以稳定表达,本结果为研究真菌高效消除蓝藻的分子机制奠定基础。