采用限制性酶切片段长度多态性和PCR指印技术对牛结核分枝杆菌分型研究

5株牛结核分枝杆菌DNA经PvuⅡ消化后 ,用来自IS10 81中的 2 48bp荧光探针杂交后进行限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)分型 ,5株牛分离株中有 4株具有相同杂交带型 ,剩余的 1株在 3.6kb处多了 1条带。将 2 48bp探针对北京牛结核分枝杆菌分离株的RFLP分型法结果与直接反向PCR分型法对上述分离株分型结果比较发现 :5株牛结核分枝杆菌分离株中有 2株具有相同的PCR指印带型 ,剩余 3株牛结核分枝杆菌分离株则PCR指印带型各不相同 ,上述结果显示出 ,直接反向PCR分型法较标准的RFLP分型法分型能力强。直接PCR法对新疆牛结核分枝杆菌分离株的分型结果显示出 ,PCR指印带型中带数较少 ,且与北京牛结核分枝杆菌分离株的PCR指印带型截然不同。

云贵两省三地带绦虫的分子鉴定——核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析

目的用PCR-RFLP方法对rDNA-ITS1片段进行分析,以进一步明确云贵地区是否存在牛带绦虫亚洲亚种,并建立一种快速鉴定方法。方法取贵州都匀株(DY)、贵州从江株(CJ)、云南大理株(DL)带绦虫及台湾株(TW)成虫标本,剪取孕节,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1片段,分别用4种限制性内切酶MspI、CfoI、AluI、RsaI对扩增片段作酶切分析。结果PCR产物经AluI、RsaI酶切后,TW、DL、DY和CJ株RFLP图谱一致;经MspI、CfoI酶切后,TW、DL和DY株RFLP图谱一致,CJ株显著不同。结论1)DL和DY株与TW株同属牛带绦虫亚洲亚种;而CJ株是传统牛带绦虫;2)rDNA-ITS1的PCR-RFLP分析方法简便,可以用于带绦虫的分类学研究。

应用限制性酶切片段长度多态性及变性高效液相色谱法筛选胶质瘤易感基因ERCC2的单核苷酸多态性比较

目的利用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)及变性高效液相色谱法(DHPLC)筛选和鉴定脑胶质瘤易感基因———切除修复鼠缺陷交叉互补基因2 (ERCC2)的单核苷酸多态性(SNPs)。方法应用PCR扩增179例胶质瘤病人肿瘤及血液标本和44例正常对照组血液标本ERCC2基因第23外显子及其邻近的部分内含子序列,采用限制性酶切及DHPLC技术对扩增片段进行基因变异检测,直接测序不同类型的PCR片段,并与参考序列进行对比分析。结果在此片段中验证了一个已知白种人存在的SNP位点。结论黄种人亦存在rs13181,并影响蛋白编码;可能与胶质瘤的发病有关联。DHPLC相对于RFLP来说是一种高效、经济、简便、可靠的SNPs筛选方法。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

家蚕卵线粒体DNA限制性内切酶长度多态性研究

利用 2 9种限制性内切酶对 34个不同品种家蚕卵mtDNA进行酶切分析 ,发现一化、二化品种与多化品种的HaeⅢ酶切图谱有差异 ,但不同的地理品种间没有出现酶切多态性现象。另外 ,一些家蚕品种的受精卵和非受精卵mtDNA在BglⅠ和PstⅠ酶切下 ,呈现不同的酶切带型。同时 。

限制性片段长度多态性分析酶切条件的优化

目的：对结核分枝杆菌RFLP—DNA分型技术的各个环节进行优化，以提高DNA指纹的清晰度和稳定性。方法：提取结核分枝杆菌DNA，经PvuII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳、southern转印，并用经地高辛随机引物标记试剂盒标记IS6110的245bp探针进行杂交。结果：用于结核分枝杆菌DNARFLP分析的最佳DNA浓度是2μg，内切酶浓度为2u／μgDNA，酶切反应时间为4h。结论：RFLP的酶切条件经过合理优化，可以在消耗最低的情况下取得最佳的实验效果。

天麻扩增酶切片段长度多态性反应体系的建立

目的:以天麻为试验材料,建立扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系。方法:对天麻DNA提取、酶切-连接、预扩增和选择性扩增等试验过程进行研究。结果:得到了清晰的天麻AFLP指纹图谱。结论:该体系具有良好的稳定性和重复性。

1997-1998泰国的全国样本结核分枝杆菌限制性内切酶片段长度多态性研究

地点:1997-1998 年间,作为全球项目的一部分,在泰国进行了全国性的抗结核药物耐药监测。目的:评价 IS6110 杂交带谱和成簇的水平,由于样本收集时间较短,预计不会太高。设计:共计 828 株分离株可做标准的 IS6110 杂交指纹分析。结果:随着地理位置、病人年龄、对利福平和链霉素耐药的变化,限制性片段长度多态性也随之变化。北京株在青年病人中常见,离曼谷越远,其流行率也越低,但只有一个杂交带的分离株则正好相反。排除含有 5 个以下拷贝 IS6110 的菌株,26.4%的菌株成簇。成簇在女性患者中更普遍。成簇菌株常常来自不同省份,如果有耐药,它们的耐药谱也不同。结论:在泰国某些地区用 IS6110 杂交带谱的成簇性来推断近期传播的可靠性值得怀疑。在结核病高流行国家进行全国性的近期传播研究的评价应该谨慎。

云南马关县矮马线粒体DNA的限制性片段长度多态性分析

云南马关县矮马线粒体ＤＮＡ的限制性片段长度多态性分析云南省畜牧兽医科学研究所解德文中科院昆明动物研究所刘爱华，林世英高等动物线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）是共价闭合环状的核外遗传物质，而核外遗传又是母体遗传，不发生重组，ｍｔＤＮＡ对于研究亲缘关系较近的群...

延吉市土壤中分离的棘阿米巴CJY/S3线粒体DNA限制性片段长度多态性

[目的]观察棘阿米巴土壤分离株CJY/S3的线粒体DNA限制性片段长度多态性.[方法]从棘阿米巴CJY/S3提取线粒体DNA,用EcoRI进行酶切,与广东地区土壤分离株CG/S1进行比较观察限制性片段长度多态性.[结果]延吉市土壤分离株CJY/S3与广东地区土壤分离株CG/S1具有相同的片段模式.[结论]延吉市棘阿米巴土壤分离株CJY/S3与CG/S1具有密切的亲缘关系,而线粒体DNA限制性片段长度多态性分析是棘阿米巴分类简便且有效的方法.

基于聚合酶链式反应⁃限制性内切酶长度多态性方法鉴别鹿角(马鹿)药材及其配方颗粒

鹿角为鹿科马鹿Cervus elaphus或梅花鹿C.nippon已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基。目前市场上鹿角基原混杂,为快速准确地鉴别鹿角多基原及混伪品,研究通过比较马鹿、梅花鹿及其混伪品线粒体条形码Cytb基因序列差异,筛选获得鹿角的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计鹿角特异性鉴别引物dishmy⁃F及dishmy⁃R,分别采集鹿角及其混伪品,建立鹿角配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系,对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性和适用性考察,再使用限制性内切酶MseⅠ对梅花鹿与马鹿的扩增产物进行酶切。结果显示,当退火温度为56℃,循环次数为35时,鹿角药材、标准汤剂及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后,马鹿可在近100 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,且马鹿的条带较梅花鹿短约60 bp,而其他混伪品如驼鹿、驯鹿、白尾鹿、黑尾鹿、狍子、白唇鹿等及阴性对照均无条带。该研究建立的PCR⁃RFLP方法可快速准确的鉴别出鹿角药材、标准汤剂和配方颗粒中的马鹿成分,并可区分梅花鹿和其他混伪品,同时为其他中药配方颗粒质量标准研究提供了理论依据。

瓯江彩鲤线粒体DNA的限制性内切酶分析

用 13种限制性内切酶对瓯江彩鲤的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析 ,结果表明 :(1)共产生 18种限制性态型 ,其中 5种酶产生限制性片段长度多态性 (RFLPs) ,归结为 5种基因单倍型。 (2 )瓯江彩鲤mtDNA大小为 16 .6 0± 0 .15kb ,单倍型间的基因多样性指数和群体核苷酸多样性指数分别为 0 .75 17、0 .0 2 86 。

创造酶切位点PCR-RFLP检测PON2(rs12026)基因多态性

目的:建立简便易用的PON2基因单核苷酸多态(rs12026)的检测方法。方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR-RFLP技术判断PON2基因SNP位点多态性。结果:设计一对特异引物并PCR扩增含PON2多态位点的DNA片段,根据限制性内切酶BsmAI酶切结果判断PON2位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论:应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的PON2多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

脑出血患者脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切多态性的观察

目的探讨脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性与脑出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),对55例脑出血患者和正常对照组58例脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性分析。结果(1)正常对照组PvuⅡ等位基因频率分别为P+67.24%,P-32.76%;脑出血组PvuⅡ等位基因频率为P+63.63%,P-36.37%;脂蛋白脂酶基因PvuⅡ等位基因频率在脑出血组与正常对照组之间差异无显著性。(2)与正常对照组相比,脑出血患者组血清TG、LDL-c水平较对照组升高(P<0.05);脑出血患者组血清HDL-c、ApoAI水平较对照组降低(P<0.05)。结论脂蛋白脂酶PvuⅡ酶切多态性与脑出血无明显关联。

海南黎族人群脂蛋白酯酶基因PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系的研究

目的研究海南黎族人群脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析294例样本LPL PvuⅡ多态性(黎族146人,汉族148人)。结果黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性无明显差异,各基因型间血脂水平亦无明显差异。结论黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性未发现显著差异,健康黎族与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性与血脂水平无关联。

限制性核酸内切酶的制备、纯度鉴定和测活方法

限制性核酸内切酶(简称限制酶)主要来源于细菌,其分布广泛、种类繁多。第一个限制酶于1968年问世,迄今已发现了近500种,其中绝大部分是Ⅱ型限制酶。Ⅱ型酶是非常重要的工具酶,被誉为“分子手术刀”;也为研究两类最重要的生物大分子——蛋白质和核酸的相互作用提供了一个理想的模型。

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析 (RFLP)鉴别乙型流行性感冒 (流感 )病毒的巴拿马株与维多利亚株 ,对乙型流感病毒血凝素 (HA)基因采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增后 ,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示 :乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增 ,且与甲1与甲3 型流感病毒无交叉反应。该片段经HindⅢ酶切后 ,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现 6 0 3bp与 2 4 2bp的 2个片段 ,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无 HindⅢ酶切位点 ,仍呈 872bp的一个片段。表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充 ,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定 。