利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

限制性片段长度多态性分析酶切条件的优化

目的：对结核分枝杆菌RFLP—DNA分型技术的各个环节进行优化，以提高DNA指纹的清晰度和稳定性。方法：提取结核分枝杆菌DNA，经PvuII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳、southern转印，并用经地高辛随机引物标记试剂盒标记IS6110的245bp探针进行杂交。结果：用于结核分枝杆菌DNARFLP分析的最佳DNA浓度是2μg，内切酶浓度为2u／μgDNA，酶切反应时间为4h。结论：RFLP的酶切条件经过合理优化，可以在消耗最低的情况下取得最佳的实验效果。

1997-1998泰国的全国样本结核分枝杆菌限制性内切酶片段长度多态性研究

地点:1997-1998 年间,作为全球项目的一部分,在泰国进行了全国性的抗结核药物耐药监测。目的:评价 IS6110 杂交带谱和成簇的水平,由于样本收集时间较短,预计不会太高。设计:共计 828 株分离株可做标准的 IS6110 杂交指纹分析。结果:随着地理位置、病人年龄、对利福平和链霉素耐药的变化,限制性片段长度多态性也随之变化。北京株在青年病人中常见,离曼谷越远,其流行率也越低,但只有一个杂交带的分离株则正好相反。排除含有 5 个以下拷贝 IS6110 的菌株,26.4%的菌株成簇。成簇在女性患者中更普遍。成簇菌株常常来自不同省份,如果有耐药,它们的耐药谱也不同。结论:在泰国某些地区用 IS6110 杂交带谱的成簇性来推断近期传播的可靠性值得怀疑。在结核病高流行国家进行全国性的近期传播研究的评价应该谨慎。

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术的优点

限制性片段长度多态性（RFLP）技术是最早开发成功、建立在Southern杂交技术上的DNA分子遗传标记技术。RFLP技术的优点：

延吉市土壤中分离的棘阿米巴CJY/S3线粒体DNA限制性片段长度多态性

[目的]观察棘阿米巴土壤分离株CJY/S3的线粒体DNA限制性片段长度多态性.[方法]从棘阿米巴CJY/S3提取线粒体DNA,用EcoRI进行酶切,与广东地区土壤分离株CG/S1进行比较观察限制性片段长度多态性.[结果]延吉市土壤分离株CJY/S3与广东地区土壤分离株CG/S1具有相同的片段模式.[结论]延吉市棘阿米巴土壤分离株CJY/S3与CG/S1具有密切的亲缘关系,而线粒体DNA限制性片段长度多态性分析是棘阿米巴分类简便且有效的方法.

基于聚合酶链式反应⁃限制性内切酶长度多态性方法鉴别鹿角(马鹿)药材及其配方颗粒

鹿角为鹿科马鹿Cervus elaphus或梅花鹿C.nippon已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基。目前市场上鹿角基原混杂,为快速准确地鉴别鹿角多基原及混伪品,研究通过比较马鹿、梅花鹿及其混伪品线粒体条形码Cytb基因序列差异,筛选获得鹿角的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计鹿角特异性鉴别引物dishmy⁃F及dishmy⁃R,分别采集鹿角及其混伪品,建立鹿角配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系,对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性和适用性考察,再使用限制性内切酶MseⅠ对梅花鹿与马鹿的扩增产物进行酶切。结果显示,当退火温度为56℃,循环次数为35时,鹿角药材、标准汤剂及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后,马鹿可在近100 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,且马鹿的条带较梅花鹿短约60 bp,而其他混伪品如驼鹿、驯鹿、白尾鹿、黑尾鹿、狍子、白唇鹿等及阴性对照均无条带。该研究建立的PCR⁃RFLP方法可快速准确的鉴别出鹿角药材、标准汤剂和配方颗粒中的马鹿成分,并可区分梅花鹿和其他混伪品,同时为其他中药配方颗粒质量标准研究提供了理论依据。

瓯江彩鲤线粒体DNA的限制性内切酶分析

用 13种限制性内切酶对瓯江彩鲤的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析 ,结果表明 :(1)共产生 18种限制性态型 ,其中 5种酶产生限制性片段长度多态性 (RFLPs) ,归结为 5种基因单倍型。 (2 )瓯江彩鲤mtDNA大小为 16 .6 0± 0 .15kb ,单倍型间的基因多样性指数和群体核苷酸多样性指数分别为 0 .75 17、0 .0 2 86 。

脑出血患者脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切多态性的观察

目的探讨脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性与脑出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),对55例脑出血患者和正常对照组58例脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性分析。结果(1)正常对照组PvuⅡ等位基因频率分别为P+67.24%,P-32.76%;脑出血组PvuⅡ等位基因频率为P+63.63%,P-36.37%;脂蛋白脂酶基因PvuⅡ等位基因频率在脑出血组与正常对照组之间差异无显著性。(2)与正常对照组相比,脑出血患者组血清TG、LDL-c水平较对照组升高(P<0.05);脑出血患者组血清HDL-c、ApoAI水平较对照组降低(P<0.05)。结论脂蛋白脂酶PvuⅡ酶切多态性与脑出血无明显关联。

扩增片段长度多态性技术在动物遗传多样性研究中的应用

扩增片段长度多态性(AFLP)是一种有效的分子遗传标记方法,具有快速、经济、简便、模板需要量少、重复性高、结果可靠等优点。目前AFLP在动物方面的应用还不是很多,处于初级阶段,主要用于鉴定分类关系、种群遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建等方面。

海南黎族人群脂蛋白酯酶基因PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系的研究

目的研究海南黎族人群脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析294例样本LPL PvuⅡ多态性(黎族146人,汉族148人)。结果黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性无明显差异,各基因型间血脂水平亦无明显差异。结论黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性未发现显著差异,健康黎族与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性与血脂水平无关联。

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）基本原理和特点

扩增片段长度多态性（AFLP）是建立在RFLP基础上的选择性聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction．PCR），它的基本原理是对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，将人工合成的特定双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，用这些特异片段为扩增反应模板，通过接头序列和PCR引物3’一端选择性碱基的识别，

甲烯四氢叶酸还原酶基因多态性与2型糖尿病的关系

目的 :探讨中国人群 2型糖尿病患者中甲烯四氢叶酸还原酶 ( MTHFR)基因多态性与2型糖尿病发病的关系。方法 :采用 PCR技术和限制性内切酶片段长度多态性 ( RFLP)的方法检测患者的 MTHFR基因 677C→ T突变 ,统计各组对象的突变频率。结果 :MTHFR基因 677C→ T突变型等位基因 ( T)频率在病例组和对照组中差异无显著性 ( χ2 =2 .2 9,P>0 .0 5 ) ,TT、CT和CC3种基因型频率差异无显著性。基因型频率的相对风险分析 ,CT基因型患 2型糖尿病风险是CC基因型的 1 .96倍 ,TT基因型患 2型糖尿病风险是 CC基因型的 2 .5 7倍。结论 :MTHFR基因突变型等位基因与 2型糖尿病发生无必然的联系 ,突变基因型并没有增加

中国汉族人群N-乙酰基转移酶1基因多态性的检测分析

目的 探讨N 乙酰基转移酶1(NAT1)基因型检测方法及其基因多态性的分布。方法 在140名汉族健康人的外周血中,应用聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性分析(RFLP)及多重PCR技术,进行NAT1等位基因分型研究。结果 应用PCR- RFLP+多重PCR方法避免了多种限制性内切酶之间相互干扰,可准确区分NAT1基因型。在140名检测标本中,NAT1* 3,NAT1* 4,NAT1* 10和NAT1* 11的发生频率分别是8 .2%、49. 6%、40%和2 2%。NAT1* 4发生率明显低于欧美人群,但高于东南亚人群;而NAT1* 10的发生率高于欧美人群,NAT1* 3和NAT1* 11的发生率较低,与大多数亚洲人群基本一致。结论 PCR RFLP+多重PCR方法检测NAT1基因型特异性高;NAT1基因型分布与其他国家检测情况有所差异。

青海省汉族妊娠期高血压疾病与维生素D受体基因FokⅠ多态性的关系

目的 探讨维生素D受体(VDR)基因单核苷酸多态性(SNP)FokⅠ(rs2228570/rs10735810)位点多态性与青海省汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDCP)的相关性。方法 选择青海省汉族HDCP患者137例(HDCP组),正常汉族孕妇146例(对照组),使用聚合酶链式反应-限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测HDCP组和对照组FokⅠ位点的基因分型并测序验证,使用SPSS 19.0统计学软件检验两组一般临床资料、基因型及等位基因频率分布差异是否具有统计学意义。结果 HDCP组和对照组FokⅠ位点FF、Ff、ff基因型频率分别为51.82%、37.96%、10.22%和34.93%、43.15%和21.92%(χ^(2)=11.099,P<0.05),HDCP组FF基因型(OR=2.004,95%CI=1.243~3.231)频率高于对照组;HDCP组和对照组FokⅠ位点F和f等位基因频率分布差异有统计学意义(χ^(2)=12.454,P<0.001),HDCP组F等位基因(OR=1.253,95%CI=1.105~1.421)频率高于对照组。结论 VDR基因FokⅠ位点多态性与青海省汉族HDCP相关,其中F等位基因可能是HDCP的易感基因,FF基因型可能是HDCP的易感基因型。

血管紧张素转换酶和血管紧张素原基因多态性及其与青海妊娠高血压疾病的相关性

目的探讨血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素原(AGT)基因表达、基因多态性与青海孕产妇妊娠高血压疾病的相关性。方法选择210例妊娠高血压患者(HDCP组)和220例正常孕妇(CK组),运用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测AGT M235T、ACE I/D基因多态性。结果CK组ACE基因DD、ID、Ⅱ所占比例分别为28.18%、47.73%、24.09%,HDCP组分别为33.81%、51.90%、14.29%(P<0.05,故两组的ACE基因分布有差异),HDCP组和对照组ACE I/D多态性等位基因I和D频率分布有差异(P<0.05),HDCP组D等位基因频率高于对照组(χ^2=5.188,P<0.05),ACE基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^2=0.423,df=2,查表χ^2界值表,P>0.05,达到遗传平衡);CK组AGT基因MM、MT、TT所占比例分别为24.09%、43.64%、32.27%,HDCP组分别为15.71%、42.86%、41.43%(P<0.05,故两组的AGT基因分布差异有统计学意义),HDCP组和对照组AGT M235T多态性等位基因M和T频率分布有差异性(P<0.05),HDCP组T等位基因频率高于对照组(χ^2=6.796,P<0.05),AGT基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^2=3.242,df=2,查表χ^2界值表,P>0.05,达到遗传平衡)。结论ACE I/D多态性和AGT M235T多态性与青海省汉族妊娠期高血压疾病有关,D等位基因和T等位基因可能是妊娠高血压疾病的易感基因。

青海汉族妊娠期高血压疾病白细胞介素10基因启动子区-592A/C多态性分子特征

目的探讨白细胞介素10(IL-10)基因启动子区-592A/C(rs1800872)多态性与青海汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDP)的相关性,并确定该基因在HDP组和健康对照组中的表达情况。方法选择青海省HDP患者(HDP组)和正常妊娠妇女(对照组)各140例,以血液DNA为模板,应用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测HDP组和对照组IL-10-592A/C多态性分型并测序验证。应用Real-time PCR检测两组胎盘组织中IL-10 mRNA的表达。应用ELISA检测两组血浆IL-10水平。结果HDP组和对照组IL-10基因AA、AC、CC基因型频率分别为24.29%、44.29%、31.42%和13.57%、41.43%、45.00%,两组基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);AA基因型频率HDP组(24.29%)高于对照组(13.57%)(P<0.05),CC基因型频率HDP组(31.42%)低于对照组(45.00%)(P<0.05),而AC基因型频率两组间差异无统计学意义(P>0.05);IL-10-592A/C多态性A、C等位基因频率两组间分布有差异,HDP组A等位基因频率高于对照组(χ^(2)=8.079,P<0.05);HDP组胎盘组织中IL-10 mRNA表达量低于对照组(P<0.01);HDP组血浆IL-10水平(1.53±0.68)ng/L低于对照组(1.79±0.72)ng/L(P<0.01)。结论IL-10-592A/C多态性与青海汉族HDP相关;IL-10-592A/C多态性中A等位基因可能通过调节IL-10的表达参与HDP的遗传易感性。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与青海汉族妊娠期高血压疾病的相关性

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因-677C/T(rs1801133)多态性与青海汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDP)的相关性。方法选择青海省HDP患者139例(HDP组),正常妊娠孕妇145例(对照组),应用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法,检测HDP组和对照组MTHFR-677C/T多态性分型并测序验证。结果HDP组和对照组MTHFR基因CC、CT、TT基因型频率分别为54.68%、35.25%、10.07%和69.66%、22.06%、8.28%,CC基因型频率HDP组54.68%低于对照组69.66%(P<0.05),CT基因型频率HDP组35.25%高于对照组22.06%(P<0.05),而TT基因型频率HDP组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);HDP组和对照组MTHFR-677C/T多态性C和T等位基因频率分布有差异(P<0.05),HDP组T等位基因频率高于对照组(χ^(2)=5.568,P<0.05)。结论MTHFR基因-677C/T多态性与青海汉族HDP相关,MTHFR基因-677C/T多态性中T等位基因可能是HDP的易感基因,CT基因型为HDP的易感基因型。

内皮型一氧化氮合酶基因G894T位点多态性与妊娠期高血压疾病患者脂代谢的相关性

目的 探讨内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因G894T位点多态性与妊娠期高血压疾病(HDCP)患者脂代谢的相关性。方法 选择邢台市第三医院2016年1月~2020年1月收治的528例HDCP患者为研究对象,并以同期128例正常妊娠者作为对照组。采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血,并检测血脂指标、胱抑素(CysC)及尿酸等生化指标水平。根据血脂水平分为血脂正常组和异常组,血脂异常组包括4个亚组[高三酰甘油(TG)血症组(TG≥1.70 mmol/L)、低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症组(HDL-C<1.04 mmol/L)、高总胆固醇(TC)血症组(TC≥5.18 mmol/L)、混合型高脂血症组(TG≥1.70 mmol/L、TC≥5.18 mmol/L)]。另采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度片段多态性(PCR-RFLP)方法对eNOS基因G894T位点进行基因分型分析,分为TT、GT、GG基因型。比较不同血脂水平者的基因多态性分布情况,并采用Logistic回归分析方法探讨血脂异常影响因素以及eNOS基因G894T位点多态性与血脂异常之间的关系。结果 研究组和对照组中GG、GT、TT eNOS基因G894T位点基因型的期望值和观测值均符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=0.651,P=0.722;χ^(2)=1.845,P=0.398),且研究组GG型基因频率和G等位基因频率高于对照组,TT型基因频率和T等位基因频率低于对照组(P<0.05);血脂异常组患者身体质量指数(BMI)、尿微量白蛋白与肌酐比值(UACR)、同型半胱氨酸(Hcy)、尿酸以及C-反应蛋白(CRP)水平相较于血脂正常组显著升高,但其降压药服用率更低(P<0.05)。血脂异常组eNOS基因(G894T)基因的GG基因频率和G等位基因高于血脂正常组,TT基因频率和T等位基因低于血脂正常组(P<0.001)。低HDL-C血症组、高TG血症组以及混合型高脂血症组患者的BMI均高于血脂正常组(P<0.05);混合型高脂血症组患者Hcy水平高于血脂正常组(P<0.05)。低HDL-C血症组和混合型高脂血症组的TT基因频率和T等位基因明显低于血脂正常组,GG基因频率和和G等位基因频率高于血脂正常组(P<0.05)。Logistic回归分析表明,基因型TT属于HDCP血脂水平异常的一种保护因素,基因型GG、高BMI、高Hcy水平属于血脂异常的独立危险因素。结论 妊娠期高血压疾病患者的eNOS基因G894T位点多态性与血脂异常之间相关性显著,其中基因型TT属于保护因素,基因型GG/GT属于独立危险因素;同时BMI、Hcy也会对血脂异常产生影响。