在基因序列中高效引入多位点突变的方法

背景与目的在基因序列中引入点突变是研究基因结构和功能及其相关性的重要手段。目前已有多种对基因序列进行突变的方法,然而,这些方法大多对单一位置的基因突变有效,而对在基因序列中引入多位点突变,还有待方法的进一步改进。为适应这一需要,本研究提供了一种高效的可在基因序列的多个位点引入突变的方法。方法该方法依赖于一种Type IIs类的限制性内切酶,例如Esp 3I等。本研究所提供的方法中,针对每一个突变位点,合成一对含有突变点和所选择的Type IIs类的限制性内切酶位点的引物,当需要引入多位点突变时,则利用邻近的两个突变位点的引物做PCR反应,多个位点的突变,就可以得到多个扩增片段,将这些片段用和引物上的限制性内切酶位点对应的酶进行反应,然后用连接反应将片段连接形成突变基因。结果本研究所提供的方法非常简便,主要实验步骤可以在一天之内完成。我们已经利用这种方法,在绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)和nm23基因中,引入3个或4个突变,突变效率几乎为100%。结论本研究所提供的方法可以成为研究基因功能的有用工具。

鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换

采用双融合PCR(doublefusionPCR)的方法将鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)的强毒株的VP2 片段替换为疫苗株的相应片段以获得重组的病毒粒子。首先将被替换片段两侧的片段从强毒株的载体上扩增下来 ,并将目的片段从疫苗株序列的载体上扩增下来。然后用融合PCR的方法将目的片段与其上游片段融合起来 ,回收产物并将其与下游片段融合起来 ,最终得到了替换后的新序列。双融合PCR提供了一种快速、精确和不受酶切位点限制的片段替换方法。

在长载体中引入定点突变的方法

背景与目的体外基因定点突变是分子生物学实验的常用方法。然而,虽然目前已经报道了多种基因突变的方法,但对于在长的载体序列中引入突变,一般的方法并不太容易实现。方法本研究在我们前期报告的基因突变方法的基础上,描述了一种简单易操作的可在长序列中引入定点突变的方法。这个方法的基本实验程序是:①确定待突变区域,合成一对均含有Type IIs类限制性内切酶位点载体引物,并合成一对互补的突变单链;②在突变区域之外的合适位置上,选择一个桥点,并合成一对均含有Type IIs类的限制性内切酶位点的桥点引物;③利用载体引物序列和桥点引物序列做PCR反应,以扩增载体序列中突变区域外的序列;④利用相应的Type IIs类的限制性内切酶,对以上扩增产物进行酶切;⑤将酶切产物和两个突变单链复性成的突变双链连接,形成突变载体,并转化进受体菌作克隆鉴定。结果为证明我们所报告的方法的有效性,我们在长的载体中进行了测试,结果显示,不但实验操作简单易行,而且突变效率可达到90%以上。结论我们提供了一种有效的在长载体中进行定点突变的方法。

Construction the hairpin RNA recombinant plasmids targeting human Pokemon gene

Objective： The aim of this study was to establish the foundation for studying the role of pokemon gene in tumori- genesis and development by constructing recombinant plasmids that can express small interfering RNA （siRNA） targeting human Pokemon gene. Methods： Hairpin siRNA templates targeting Pokemon gene were synthesized and cloned into plasmid vector psiRNA-Hineo. Three vectors derived siRNAs （psiRNA1, 2, 3） and one mocking psiRNAc （as control） were constructed. The recombinant Pokemon siRNA plasmids were constructed and identified using restrictive enzyme analysis and DNA sequencing, Results： Restrictive enzyme analysis and DNA sequencing revealed the successful construction of siRNA expression plasmids. Conclusion： Constructing siRNAtemplates targeting Pokemon gene may provide us with practical tools for further study the role of Pokemon gene in the development of some diseases and gene therapy of tumor.