利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

家蚕卵线粒体DNA限制性内切酶长度多态性研究

利用 2 9种限制性内切酶对 34个不同品种家蚕卵mtDNA进行酶切分析 ,发现一化、二化品种与多化品种的HaeⅢ酶切图谱有差异 ,但不同的地理品种间没有出现酶切多态性现象。另外 ,一些家蚕品种的受精卵和非受精卵mtDNA在BglⅠ和PstⅠ酶切下 ,呈现不同的酶切带型。同时 。

大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术及其优化

建立和优化了大麦DNA单限制性酶切选择性扩增多态性技术体系 (SADF)。分别用限制酶PstI、EcoRI和MseI酶切大麦基因组DNA ,再与各自相应的人工接头连接 ,使用带三个选择碱基的引物进行选择性扩增。结果表明 :采用分别优化建立的标准PCR扩增检测体系 ,六个识别碱基的PstI和EcoRI的SADF均能得到丰富稳定的带形 ,四个识别碱基的MseI不能得到明显谱带。SADF扩增产物片段大小范围为 :PstI一般在 2 0 0～ 2 0 0 0bp ,而EcoRI在 2 0 0～ 10 0 0bp ;两者在不同大麦品种中均能检测到多态性 ,可用于不同大麦品种的检测 ,但PstI得到的带型明显优于EcoRI,在大麦中得到的片段具有范围宽、分布均匀、易于观察、多态性高等特点。

限制性内切酶SmaⅠ和HincⅡ存在切割序列多态性

ＰＣＲ扩增产物基因组Ｇ—ＣＳＦ基因被克隆至ｐＵＣ１９，在对其进行序列分析时发现，Ｓｍａ Ⅰ和ＨｉｎｃⅡ共同使用对回收片段进行亚克隆时，有一段序列缺失，序列分析表明这可能是由于Ｓｍａ Ⅰ和Ｈｉｎｃ Ⅱ同时使用造成的。Ｓｍａ Ⅰ和Ｈｉｎｃ Ⅱ可能存在切割序列多态性。

用限制性内切酶多态性分析23SrRNA快速鉴定李斯特菌种

目的为快速鉴定六种李斯特菌。方法用 PCR 扩增六种参考李斯特菌23SrRNA 基因片段 S_1、S_2,再用限制性内切酶 S_1、S_2,用 API 反应条同时做生化反应。结果 S_2用 XmnI 或 CfoI 酶切,S_2用 AluI 或 ClaI 酶切,可以分别鉴定出这六种参考李斯特菌,结果与 API 反应条一致。结论 PCR-RFLP 能快速、方便地用于李斯特菌的鉴定,且方法可靠、实用,可应用于食品和环境微生物的鉴定。

限制性片段长度多态性分析酶切条件的优化

目的：对结核分枝杆菌RFLP—DNA分型技术的各个环节进行优化，以提高DNA指纹的清晰度和稳定性。方法：提取结核分枝杆菌DNA，经PvuII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳、southern转印，并用经地高辛随机引物标记试剂盒标记IS6110的245bp探针进行杂交。结果：用于结核分枝杆菌DNARFLP分析的最佳DNA浓度是2μg，内切酶浓度为2u／μgDNA，酶切反应时间为4h。结论：RFLP的酶切条件经过合理优化，可以在消耗最低的情况下取得最佳的实验效果。

毛细管电泳-激光诱导荧光检测分枝杆菌脱氧核糖核酸限制性内切酶谱

建立了毛细管电泳分离 激光诱导荧光检测(CE LIFD)分析分枝杆菌脱氧核糖核酸(DNA)限制性内切酶谱的新方法。用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439bp的片段,该扩增片段经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后,分别用CE LIFD装置和常规琼脂糖电泳(AGE)对比检测酶切片段。对PCR扩增片段的酶切样品的预处理和CE条件进行了优化,获得了8种分枝杆菌DNA的限制性内切酶谱图。DNA片段相对迁移时间的相对标准偏差(RSD)≤3 6%。结果表明,CE的分离效能明显高于AGE,是研究DNA限制性内切酶谱的更有效的检测手段。

鸡贫血病毒国内分离株的酶切图谱多态性分析

用套式PCR 扩增了鸡贫血病毒(CAV)长度为687 bp 的特异片段,以Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ、Hpa Ⅱ分别酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了其限制性酶切片段的多态性。对几株国内外分离株的分析表明,TK5803和山东分离株SJ1、SJ2 应属于Todd 的限制性内切酶酶切图谱多态性分析法(RFLP)分类中的第2 组;吉林JL1 株和哈尔滨CL1 株相同,但与其他任何毒株均不相同,大连DL1 株也不同于任何现有毒株,因而都不能归属于Todd 划分的7 个小组;荷兰弱毒株与目前发现的所有毒株均不同,具有其特征性的酶切图谱。

中国昆明(KM)小鼠线粒体DNA限制性内切酶图谱的研究

线粒体DNA的限制性内切酶图谱在不同的种系及亚种间存在多态性。我们分别用五种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅡ、HidⅢ、PstⅠ、MspⅠ对60只中国KM小鼠(雌雄各半)的线粒体DNA进行了酶切电泳分析,结果未发现多态性,且这五种限制性内切酶图谱均与BALB/c小鼠相同。这表明中国KM小鼠与绝大多数实验小鼠一样,均起源于欧州的野鼠M.m.domesticu。未见到KM小鼠经其它亚种野鼠母系遗传污染的迹象。

琼脂糖凝胶电泳的条件优化——质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定

随着质粒构建,转染,扩增等基因表达相关的分子生物学技术在科研中的广泛开展,DNA的琼脂糖凝胶电泳技术由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定生物大分子（核酸）的重要手段和常用方法。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素很多,包括DNA分子大小和构象,琼脂糖浓度,所加电压,电泳缓冲液的离子浓度,

1997-1998泰国的全国样本结核分枝杆菌限制性内切酶片段长度多态性研究

地点:1997-1998 年间,作为全球项目的一部分,在泰国进行了全国性的抗结核药物耐药监测。目的:评价 IS6110 杂交带谱和成簇的水平,由于样本收集时间较短,预计不会太高。设计:共计 828 株分离株可做标准的 IS6110 杂交指纹分析。结果:随着地理位置、病人年龄、对利福平和链霉素耐药的变化,限制性片段长度多态性也随之变化。北京株在青年病人中常见,离曼谷越远,其流行率也越低,但只有一个杂交带的分离株则正好相反。排除含有 5 个以下拷贝 IS6110 的菌株,26.4%的菌株成簇。成簇在女性患者中更普遍。成簇菌株常常来自不同省份,如果有耐药,它们的耐药谱也不同。结论:在泰国某些地区用 IS6110 杂交带谱的成簇性来推断近期传播的可靠性值得怀疑。在结核病高流行国家进行全国性的近期传播研究的评价应该谨慎。

赖型钩端螺旋体重组DNApCX7的特异性鉴定和限制性内切酶谱分析

本实验将赖型钩端螺旋体（简称钩体）ＤＮＡ基因库的克隆ｐＣＸ７制备成￣（３２）Ｐ－重组ＤＮＡ探针，对８个不同血清群的１７株问号状钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃⅠ株以及细螺旋体３０５５株ＤＮＡ进行打点杂交；同时用１５种ＤＮＡ片断进行限制性内切酶谱分析。结果表明，该重组ＤＮＡ具有问号状钩体种（Ｓｐｅｃｉｅｓ）特异性，但与不同问号状钩体之间的同源性程度有差别；限制性内切酶谱分析发现ｐＣＸ７重组ＤＮＡ片段长约１．７ｋｂ，具有１个Ｂｇ１Ⅱ识别位点和３个ＢｓｔＢ１识别位点。

几株结核杆菌DNA的限制性内切酶谱比较

改良了一种从结核杆菌中提取高分子量ＤＮＡ的方法，并将所获得的三株人型结核杆菌（两株地方株、一株标准株），一株牛型结核杆菌的ＤＮＡ用于ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ四种不同的限制性内切酶的消化，经电泳后产生了它们各自的酶谱。结果显示出，牛型结核杆菌的四种酶谱均显著区别于三株人型结核杆菌，说明它作为独立的型别存在；人型结核杆菌标准株的ＰｓｔＩ酶谱与两株人型结核杆菌地方株存在显著差异；而两株人型结核杆菌地方株之间四种酶谱均相似。结果提示；若用限制性内切酶消化整个染色体ＤＮＡ所产生的酶切图谱，尚难辩认出特征性酶切条带。

三种鱼mtDNA的限制性内切酶分析

鱼类线粒体DNA(mtDNA)的限制性酶切图谱分析,对于探讨鱼类的起源和演化等方面均有十分重要的意义。但是目前有关鱼类mtDNA酶切图谱的研究较少,这主要是受方法学的限制。为此我们改良了一种鱼类mtDNA的提取法,对鲤科的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙鱼(Aristi-chthys nobilis)的mtDNA进行了限制性内切酶酶切分析。

优化的热启动PCR-限制性酶切法检测冠心病患者载脂蛋白E基因型

改进传统的载脂蛋白Ｅ（Ａｐｏ Ｅ）基因多态性检测方法，建立热启动聚合酶链反应 （ＰＣＲ）－限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）检测分析方法。方法：应用热启动ＰＣＲ－限制性内切酶酶 切－聚丙烯酸胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）－固定银染法测定１５８例冠心病（ＣＨＤ）患者和１１６例正常对照者 的 Ａｐｏ Ｅ基因型。结果：检测结果清晰，非特异扩增极少。共检测出 ５种 Ａｐｏ Ｅ基因型，分别为 Ｅ３／ ３、Ｅ３／２、Ｅ４／３、Ｅ４／２及 Ｅ４／４。 ＣＨＤ组 Ａｐｏ Ｅ４／３基因型和４等位基因频率均高于对照组（Ｐ＜ ０．０５）。结论：Ａｐｏ Ｅ基因多态性与ＣＨＤ发生密切相关，４等位基因似是ＣＨＤ重要的遗传易患因 素。

瓯江彩鲤线粒体DNA的限制性内切酶分析

用 13种限制性内切酶对瓯江彩鲤的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析 ,结果表明 :(1)共产生 18种限制性态型 ,其中 5种酶产生限制性片段长度多态性 (RFLPs) ,归结为 5种基因单倍型。 (2 )瓯江彩鲤mtDNA大小为 16 .6 0± 0 .15kb ,单倍型间的基因多样性指数和群体核苷酸多样性指数分别为 0 .75 17、0 .0 2 86 。

脑出血患者脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切多态性的观察

目的探讨脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性与脑出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),对55例脑出血患者和正常对照组58例脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性分析。结果(1)正常对照组PvuⅡ等位基因频率分别为P+67.24%,P-32.76%;脑出血组PvuⅡ等位基因频率为P+63.63%,P-36.37%;脂蛋白脂酶基因PvuⅡ等位基因频率在脑出血组与正常对照组之间差异无显著性。(2)与正常对照组相比,脑出血患者组血清TG、LDL-c水平较对照组升高(P<0.05);脑出血患者组血清HDL-c、ApoAI水平较对照组降低(P<0.05)。结论脂蛋白脂酶PvuⅡ酶切多态性与脑出血无明显关联。

海南黎族人群脂蛋白酯酶基因PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系的研究

目的研究海南黎族人群脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)PvuⅡ酶切位点多态性及其与血脂水平关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析294例样本LPL PvuⅡ多态性(黎族146人,汉族148人)。结果黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性无明显差异,各基因型间血脂水平亦无明显差异。结论黎族人群与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性未发现显著差异,健康黎族与汉族人群LPL PvuⅡ基因多态性与血脂水平无关联。

伤寒沙门菌CWDMs染色体的限制性内切酶谱分析

目的了解伤寒沙门菌CWDMs染色体的特点,探讨限制性内切酶谱在伤寒沙门菌CWDMs检测的应用价值。方法对伤寒沙门菌CWDMs染色体的特异性PCR扩增产物进行限制性内切酶谱分析。结果限制性内切酶谱分析显示伤寒沙门菌CWDMs具有与其亲代细菌型相同的酶谱。结论可用限制性内切酶谱分析对伤寒沙门菌CWDMs进行检测。