常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变

目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。

致病性钩端螺旋体限制性内切酶酶切分析分型研究

为了建立一种简便、稳定的钩体分型方法，我们采用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ对致病性钩端螺旋体八个血清群５４个血清型６４株国内外钩体参考株及２７株野生株进行限制性内切酶酶切分析（ＲＥＡ）。结果表明：９１株菌中共有５９种不同的限制性内切酶图谱（ＲＥＰｓ），根据前５条高分子酶切片段可以区分不同的ＲＥＰｓ；除部分血清群中个别不同的血清型有相同的ＲＥＰ型外，大部份血清型都有其独特的ＲＥＰ型，同一血清群往往拥有共同的酶切片段；所研究的同一血清型的国内和国际参考株的ＲＥＰｓ不同；大多数野生株的ＲＥＡ型和参考株相同，差异仅表现为个别高分子带的缺少和增加，ＲＥＡ分型和血清分型吻合较好，通过ＲＥＡ分型基本可区分不同的血清型。

鸡贫血病毒山东分离株的限制性内切酶酶切图谱多态性分析

利用套式ＰＣＲ扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）６８７ｂｐ片段，分别以ＨａｅⅢ，ＨｉｎｆⅠ和ＨｐａⅡ酶切，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其限制性片段长度多态性。用该技术对我国山东分离株的分析表明，ＳＪ１和ＳＪ２与日本的ＴＫ５８０３株和瑞典的１／８０和１／９１株相同，应属于Ｔｏｄｄ用限制性内切酶酶切图谱多态性分析（ＲＦＬＰ）分类方法中的第２组。

钩端螺旋体DNA限制性内切酶图谱分析

七日热和波摩那各型标准株及一些野生菌株用EcoRI等六种限制性内切酶消化分析。结果表明,不同型菌株具有完全不同的酶切图谱;来自不同地域、不同时期、不同宿主的同型野生株酶谱一致,与它们相应的标准菌株没有差别或仅细小的差别。说明钩端螺旋体具有血清型特征性限制性内切酶图谱,而且是相当稳定的。我们认为限制性内切酶图谱分析是一种比较灵敏、特异、快速、简便的钩端螺旋体分类鉴定方法,还可用于分子流行病学调查。

分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析

将从自然罹死的分月扇舟蛾Closteraanastomosis (L .)幼虫中分离到的一种颗粒体病毒 (简称CaL GV)置于电子显微镜下观察 ,其形态为椭圆形 ,大小为 (30 4 .5 3× 139.0 9)nm ;经碱解病毒粒子为杆状 ,大小为(2 4 6 .2 1× 6 1.36 )nm ;经酚∶氯仿∶异戊醇 (2 5∶2 4∶1)抽提 ,氯仿∶异戊醇 (2 4∶1)洗涤 ,2倍体积无水乙醇沉淀 ,抽提的核酸经EcoRⅠ ,HindⅢ ,NcoⅠ ,PstⅠ限制型内切酶酶解 ,1×TAE缓冲液 ,0 .8%琼脂糖凝胶电泳 ,获得CaLGV核酸酶解图谱。以λDNA HindⅢ酶解片段在凝胶中的迁移率与相应片段分子量的对数值做标准曲线 ,求得CaLGV平均分子量为 10 0 .4 8kb ,核酸含量为OD2 60 /OD2 80 =1.89。

四种昆虫病毒基因组DNA限制性内切酶图谱分析

应用限制性内切酶图谱分析．结合 ＤＮＡ单分子层和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法，对黄地老虎颗粒体病毒（ＡｓＧＶ），甘兰莱粉蝶颗粒体病毒（ｐｈＧＶ），三叶草夜蛾颗粒体病毒（ＳｔＧＶ）和荨麻蛱蝶核型多角体病毒（ＡｕＮＰＶ）等四种杆状病毒提取基因组ＤＮＡ用９处限制性内切酶酶切，得到不同的酶切图谱使其在基因型上进行区分，通过ＤＮＡ单分子展层发现其核酸链都呈闭环和超螺旋构刑，用３２Ｐ标记ＡｕＮＰＶ与ＧＶ杂交，没有发现与ＧＶ的同源性。

人类疱疹病毒6型（HHV－6）分离株DNA限制性核酸内切酶酶切图谱分析研究

人类疱疹病毒６型（ＨＨＶ—６）是１９８６年新发现的疱疹病毒。限制性核酸内切酶切图谱分析表明：ＨＨＶ－６不同株之间ＤＮＡ酶切图谱呈多态性。根据酶切图谱的不同，将ＨＨＶ－６分离株分为Ａ、Ｂ二组，Ｂ组又分为Ⅰ、Ⅱ两个亚组。

四种禽源支原体核酸限制性酶切图谱分析

以ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ酶解四种禽源支原体基因组ＤＮＡ所获得的片段用琼脂糖凝胶进行电泳。结果表明，四种禽源支原体基因组ＤＮＡ经上述酶切后所获得的片段图谱有很大的差异性，表明它们之间的相关性很小；８个鸡毒支原体菌株ＤＮＡ经酶切、电泳后所获得的片段亦具有相对的差异性，说明酶切图谱分析不适用于禽类支原体种的鉴定。由于该技术有很高的分辨率，可以区分同种不同株之间的基因差异，因此，这种技术对禽类支原体病流行病学研究很有意义，并为今后禽源支原体分子生物学研究打下了基础。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

限制性内切酶的无细胞快速制备研究

限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×10^(5)~3.7×10^(6)U/mg,BamHⅠ8.3×10^(2)~4.1×10^(3)U/mg,BsaⅠ4.4×10^(5)~4.4×10^(6)U/mg)的目标蛋白。同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1~2 d)、蛋白产量高(32.5~130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×10^(5)~5.7×10^(8)U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。

福建两个蛋鸭品种和常见野鸭线粒体DNA(mtDNA)限制性酶切图谱的比较

用７种限制性内切酶（ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｏｃＲⅤ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｂａⅠ）分析了蛋鸭（金定鸭、莆田黑鸭）、野鸭（斑嘴鸭、绿头鸭）的ｍｔＤＮＡ限制性类型，并用双酶法构建了以上鸭类的ｍｔＤＮＡ限制性酶切图谱．结果表明，蛋鸭与野鸭在ｍｔＤＮＡ结构上发生了明显分岐．比较两种野鸭和金定鸭的图谱，发现金定鸭与绿头鸭的亲缘关系较近．

鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶场图谱的比较

以十一种限制性内切酶对鲢鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解的切点数：ＳａｌＩ和ＢｇｌⅡ为０；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ为１；ＨｐａＩ和ＸｂａＩ为２；ＢａｍＨＩ为３；ＢｇｌＩ和ＥｃｏＲＩ为４。以九种限制性内切酶对鳙鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解，其切点数；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＳａｌＩ．ＫｐｎＩ．ＢｇｌⅡ均为１；ＨＰａＩ和ＸｂａＩ为２；ＳａｃＩ为３；ＢｇｌＩ为４。采用琼脂糖凝胶电泳法测得鲢鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１５９３０±２２０碱基对（ｂｐ）；鳙鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１６６５０±１５０碱基对（ｂｐ）。用单、双酶解法和部份酶解法构建了鲢鱼九种酶１８个切点和鳙鱼九种酶１６个切点的限制性内切酶酶切图谱。另外，对这两种鱼的酶解位点数，片段大小和限制酶图谱进行了比较。

泥鳅线粒体DNA限制性酶切图谱

对鱼类线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）限制性内切酶图谱分析，有利于进行鱼类种间和种内遗传变异及进化的研究（张亚平等，１９９２）。目前国内外对鱼类的ｍｔＤＮＡ研究已有一些报道（陈关君等，１９８４；戴建华等，１９９４；Ａｖｉｓｅ等，１９８７；Ｂｒｏｗｎ，１９８...

伪狂犬病毒DNA限制性内切酶分析

应用５种限制性核酸内切酶（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ、ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ）建立了伪狂犬病毒闽Ａ株ＤＮＡ的内切酶图谱，并与Ｂｕｋ株、Ｓｈｏｐｅ株、Ｎｏｒｄｅｎ株、Ｓ株，台湾ＮＴＵ株进行比较，认为闽Ａ株与美国或欧洲毒株无关，而与台湾株同源，表明核酸限制性内切酶分析在伪狂犬病病毒研究中是一种毒株鉴别、分子流行病学调查的有用工具。

四个鲫鱼品系线粒体DNA的限制性酶切分析

用差速离心和核酸酶消化法从红鲫 (C auratusredvar .)、湘鲫 [F1hybridsofredcruciancarp (♀ )×commoncarp (♂ ) ]、野鲫 (C auratusauratus)和白鲫 (C auratuscuvieri)的肝组织及白鲫的卵巢中提取和纯化线粒体DNA。用 9种内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和KpnⅠ )进行单酶酶解 ,经琼脂糖凝胶电泳分析 ,检测出PstⅠ、KpnⅠ和BglⅡ 3种酶在品系间存在限制性片段长度多态性 ,但并未检测出品系内的限制性片段长度多态性。计算出红鲫、湘鲫、白鲫和野鲫的mtDNA大小分别约为 16 19、 16 0 2、 16 6 0和 16 0 6kb。根据限制性酶切片段共享度 ,计算出 4个品系间的遗传距离 ,结果表明存在直接亲缘关系的红鲫与湘鲫之间的遗传差异最小 ,证实了红鲫与子代湘鲫之间mtDNA遵循母系遗传的特性。

胡子鲇mtDNA多态性及限制性酶切图谱

用８种限制性内切酶对胡子鲇（ＣｌａｒｉａｓｆｕｓｃｕｓＬａｃｅｐｅｄｅ）肝脏线粒体ＤＮＡ（ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）进行了分析。ＸｈｏⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＸｂａⅠ、ＨｉｎｄⅢ在ｍｔＤＮＡ分子上分别有２、３、１、１、３和５个切点。胡子鲇种内存在ｍｔＤＮＡ酶切片段长度多态性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＲＦＬＰ）。经ＢｇｌⅠ、ＢｇｌⅡ酶解，ｍｔＤＮＡ都出现两种酶切类型，Ⅰ型各具２个片段，Ⅱ型各具１个片段。ｍｔＤＮＡ分子量为１０．２４２×１０６ｕ，长度约为１６．６８ｋｂ。用双酶解法建立了胡子鲇ｍｔＤＮＡ的限制性酶切图谱，并对ＲＦＬＰ现象进行了分析。

云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体DNA限制性内切酶图谱的研究

云南小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｅＫｉｎｇ）和西藏半野生小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｔｉｂｅｔａｎｕｍＳｈａｏ）是我国西部地区特有的两个普通小麦（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）亚种。我们采用改进的高离子强度法，提取云南小麦、西藏半野生小麦、普通小麦的两个品种（中国春和鄂恩１号）的叶绿体ＤＮＡ，并用７种限制性内切酶对它们的叶绿体ＤＮＡ进行了酶切图谱分析。结果表明：在普通小麦及其两个亚种中没有叶绿体ＤＮＡ的限制性片段长度差异，反映了叶绿体基因组在进化过程中相对的稳定性。

HBV P区聚合酶基因变异株的检测及限制性内切酶分析

目的 建立HBV聚合酶基因变异株DNA检测技术 ,探讨变异株的变异规律及其临床意义。方法 采用限制性内切酶酶切位点引入法设计引物检测YIDD、YVDD ,内切酶分析 ,PAGE电泳法检测DMHD、LMLL、LMAQ基因变异。结果 应用SSPⅠ及ApaL内切酶可准确地检测出YIDD和YVDD。 2 3例HBVDNA阳性病例中 ,9例YMDD未变异 ,BstNⅠ切点保持着野生型序列与参考序列相同 ;6例YMDD未变异 ,BstNⅠ切点发生变异 ;2例YMDD未变异 ,LMLL变异、BstNⅠ切点消失 ,并伴随有YAAV 4个氧基酸发生变异 ;1例YMDD未变异 ,DMHD发生变异 ;2例YIDD变异株伴随LMAQ变异、BstNⅠ切点变异 ;另 1例YIDD变异株在 50 2位 544位伴随YQHG、YKHG和SNLY、SHLY变异 ;3例YIDD和 2例YVDD病例的BstNⅠ切点均有变异。结论 研究结果发现 ,在YMDD未变异株中 50 % ( 9/1 8)为野生株 ,50 % ( 9/1 8)有基因变异 ,提示LMAQ、YIDD、YVDD变异 (W 2～W 1 2 )