常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变

目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。

云南保种山羊线粒体DNA限制性酶切研究

采用碱变性法，提取来自云南省不同地区４个保种山羊的１３个个体的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ），并用ＡｐａⅠ，ＡｖａⅠ，ＢａｍＨⅠ，ＢｃｌⅠ，ＢｃＩⅠ，ＢｇｌⅡ，ＣｌａⅠ，ＤｒａⅠ，ＥｃｏＲⅠ，ＥｃｏＲⅤ，ＨａｅⅠ，ＨｉｎｄⅢ，ＫｐｎⅠ，ＰｓｔⅠ，ＰｖｕⅡ，ＳａｃⅠ，ＳａｌⅠ，ＳｍａⅠ，ＳｔｕⅠ和ＸｈｏⅠ等２０种限制性内切酶进行酶切分析。结果发现它们的线粒体ＤＮＡ的分子量大小约为１５．８Ｋｂ；不同限制性内切酶的酶切位点分别为：ＤｒａⅠ有７个酶切位点，ＡｖａⅢ有６个酶切位点，ＥｃｏＲⅤ和ＳｔｕⅠ共有５个酶切位点，ＨｉｎｄⅡ和ＨａｅⅡ有４个酶切位点，ＢａｍＨⅠ，ＢｇｌⅡ，ＰｓｔⅠ和ＰｖｕⅡ有３个酶切位点，ＡｐａⅠ，ＣｌａⅠ有两个酶切位点，其余有１个酶切位点。各保种山羊间未发现变异，说明云南的４个保种山羊极可能来自于共同的母性祖先。

鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶场图谱的比较

以十一种限制性内切酶对鲢鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解的切点数：ＳａｌＩ和ＢｇｌⅡ为０；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ为１；ＨｐａＩ和ＸｂａＩ为２；ＢａｍＨＩ为３；ＢｇｌＩ和ＥｃｏＲＩ为４。以九种限制性内切酶对鳙鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解，其切点数；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＳａｌＩ．ＫｐｎＩ．ＢｇｌⅡ均为１；ＨＰａＩ和ＸｂａＩ为２；ＳａｃＩ为３；ＢｇｌＩ为４。采用琼脂糖凝胶电泳法测得鲢鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１５９３０±２２０碱基对（ｂｐ）；鳙鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１６６５０±１５０碱基对（ｂｐ）。用单、双酶解法和部份酶解法构建了鲢鱼九种酶１８个切点和鳙鱼九种酶１６个切点的限制性内切酶酶切图谱。另外，对这两种鱼的酶解位点数，片段大小和限制酶图谱进行了比较。

人参RAPD产物的限制性内切酶消化

为了鉴定随机扩增产物的同源性以及更有效地利用DNA分子标记研究人参种质资源，我们首次将毛细管PCR扩增的RAPD反应产物进行限制性内切酶消化并有效的进行了酶切位点分析，结果证明PCR-RFLP是筛选人参特异DNA分子标记的一种简单易行的新方法，可为药用植物种质资源研究提供另一有用的工具。

福建两个蛋鸭品种和常见野鸭线粒体DNA(mtDNA)限制性酶切图谱的比较

用７种限制性内切酶（ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｏｃＲⅤ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｂａⅠ）分析了蛋鸭（金定鸭、莆田黑鸭）、野鸭（斑嘴鸭、绿头鸭）的ｍｔＤＮＡ限制性类型，并用双酶法构建了以上鸭类的ｍｔＤＮＡ限制性酶切图谱．结果表明，蛋鸭与野鸭在ｍｔＤＮＡ结构上发生了明显分岐．比较两种野鸭和金定鸭的图谱，发现金定鸭与绿头鸭的亲缘关系较近．

泥鳅线粒体DNA限制性酶切图谱

对鱼类线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）限制性内切酶图谱分析，有利于进行鱼类种间和种内遗传变异及进化的研究（张亚平等，１９９２）。目前国内外对鱼类的ｍｔＤＮＡ研究已有一些报道（陈关君等，１９８４；戴建华等，１９９４；Ａｖｉｓｅ等，１９８７；Ｂｒｏｗｎ，１９８...

伪狂犬病毒DNA限制性内切酶分析

应用５种限制性核酸内切酶（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ、ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ）建立了伪狂犬病毒闽Ａ株ＤＮＡ的内切酶图谱，并与Ｂｕｋ株、Ｓｈｏｐｅ株、Ｎｏｒｄｅｎ株、Ｓ株，台湾ＮＴＵ株进行比较，认为闽Ａ株与美国或欧洲毒株无关，而与台湾株同源，表明核酸限制性内切酶分析在伪狂犬病病毒研究中是一种毒株鉴别、分子流行病学调查的有用工具。

四个鲫鱼品系线粒体DNA的限制性酶切分析

用差速离心和核酸酶消化法从红鲫 (C auratusredvar .)、湘鲫 [F1hybridsofredcruciancarp (♀ )×commoncarp (♂ ) ]、野鲫 (C auratusauratus)和白鲫 (C auratuscuvieri)的肝组织及白鲫的卵巢中提取和纯化线粒体DNA。用 9种内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和KpnⅠ )进行单酶酶解 ,经琼脂糖凝胶电泳分析 ,检测出PstⅠ、KpnⅠ和BglⅡ 3种酶在品系间存在限制性片段长度多态性 ,但并未检测出品系内的限制性片段长度多态性。计算出红鲫、湘鲫、白鲫和野鲫的mtDNA大小分别约为 16 19、 16 0 2、 16 6 0和 16 0 6kb。根据限制性酶切片段共享度 ,计算出 4个品系间的遗传距离 ,结果表明存在直接亲缘关系的红鲫与湘鲫之间的遗传差异最小 ,证实了红鲫与子代湘鲫之间mtDNA遵循母系遗传的特性。

家蚕卵线粒体DNA限制性内切酶长度多态性研究

利用 2 9种限制性内切酶对 34个不同品种家蚕卵mtDNA进行酶切分析 ,发现一化、二化品种与多化品种的HaeⅢ酶切图谱有差异 ,但不同的地理品种间没有出现酶切多态性现象。另外 ,一些家蚕品种的受精卵和非受精卵mtDNA在BglⅠ和PstⅠ酶切下 ,呈现不同的酶切带型。同时 。

团头鲂线粒体DNA的限制性内切酶图谱

用ＢａｍＨⅠ，ＢｇｌⅠ，ＢｇｌⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＨｐａⅠ，ＫｐｎⅠ，ＰｓｔⅠ，ＳａｃⅠＳａｌⅠ，ＸｂａⅠ，和ＸｈｏⅠ１１种限制性内切酶对团头鲂（ＭｅｇａｌｏｂｒａｍａａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａＹｉｈ）的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）进行了单酶切，其切点数依次为２，３，２，３，３，１、０，１，０，０和０；经琼脂糖凝胶电泳测算出各酶切片断大小，得出团头鲂ｍｔＤＮＡ分子长约１６０２０±３５６碱基对（ｂｐ），分子量６．３７×１０１８ｕ（原子质量），构建了团头鲂ｍｔＤＮＡ的限制酶图。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体DNA限制性内切酶图谱的研究

云南小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｅＫｉｎｇ）和西藏半野生小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｔｉｂｅｔａｎｕｍＳｈａｏ）是我国西部地区特有的两个普通小麦（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）亚种。我们采用改进的高离子强度法，提取云南小麦、西藏半野生小麦、普通小麦的两个品种（中国春和鄂恩１号）的叶绿体ＤＮＡ，并用７种限制性内切酶对它们的叶绿体ＤＮＡ进行了酶切图谱分析。结果表明：在普通小麦及其两个亚种中没有叶绿体ＤＮＡ的限制性片段长度差异，反映了叶绿体基因组在进化过程中相对的稳定性。

鲤鱼肝组织线粒体DNA的限制性内切酶分析

用 Eco R ,H ind ,Pst ,Bgl ,Bam H ,Xho ,Xba ,Sal 和 Kpn 共 9种限制性内切酶酶切对鲤鱼肝组织的 mt DNA进行酶解 ,利用 Gel- Pro Analyzer算出各酶切片段长度及mt DNA大小 ,测出其大小约为 1 6.61 kb( 1 kb=1× 1 0 3b) .另外 ,对电泳条件的优化进行了探讨 ,并将实验结果与以前报道的有关酶切实验结果进行了比较 ,表明鲤鱼 mt DNA的长度及限制性酶切位点均存在地域差异 .

蓖麻蚕蛹mtDNA的限制性内切酶图谱

采用碱变性法制备蓖麻蚕蛹mtDNA,经九种限制性内切酶单酶和双酶酶解后,琼脂糖凝胶电泳检测酶切位点数和酶切片段长度,根据片段的大小确定消失片段与新生片段关系,通过对片段重叠、拼接、判断各片段邻近位置,从而构建了9种限制性内切酶、共24个酶切位点蓖麻蚕蛹mtDNA酶切图谱。

利用PCR和限制性酶切技术鉴别3种鳗鱼

根据日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗3种鳗鱼的16S rRNA基因序列,设计特异性引物,进行16SrRNA基因的PCR扩增,然后对PCR产物进行ApaI酶切反应.结果显示,日本鳗和欧洲鳗的PCR产物均出现211 bp的特异性扩增条带,美洲鳗的PCR产物出现两条DNA条带;日本鳗的PCR产物经ApaI酶切产生大小为135 bp和76 bp的两条条带,而欧洲鳗的PCR产物经ApaI酶切没有变化.因此,利用该方法可鉴别出日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗等3种鳗鱼.

草鱼线粒体DNA限制性内切酶分析

本文报道了用ＢａｍＨⅠ，ＢｇｌⅠ，ＢｇｌⅡ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ，ＰｖｕⅡ，ＳａｃⅠ，ＸｂａⅠ，ＸｈｏⅠ等十种限制性内切酶酶切草鱼线粒体ＤＮＡ，计算出各酶切片段长度及草鱼ｍｔＤＮＡ大小。其中六种酶有多个切点，在所检测的样品中未发现碱基替换。

鱼类基因组结构研究——Ⅰ.染色体的限制性内切酶显带

本文报道了1种新的鱼类染色体研究方法——限制性内切酶显带技术。我们应用限制性内切酶Bsp631等分别对黄鳝和长春鳊的染色体进行显带处理,结果表明,Bsp631能使这两种鱼的染色体发生稳定的带纹分化:适度的处理产生多重的G-带状带型,而过度的处理则产生特殊的限制性内切酶抗性带型。根据显带结果分析,我们对鱼类染色体限制性内切酶显带的可行性和实用价值进行了讨论。

三种鱼mtDNA的限制性内切酶分析

鱼类线粒体DNA(mtDNA)的限制性酶切图谱分析,对于探讨鱼类的起源和演化等方面均有十分重要的意义。但是目前有关鱼类mtDNA酶切图谱的研究较少,这主要是受方法学的限制。为此我们改良了一种鱼类mtDNA的提取法,对鲤科的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙鱼(Aristi-chthys nobilis)的mtDNA进行了限制性内切酶酶切分析。

限制性内切酶缓冲液诱导人和家兔染色体显带的研究

用限制性内切酶AluI、缓冲液或空白处理人染色体标本，发现AluI及缓冲液均能诱导出类C和G带，其中缓冲液诱导的类C带频率虽低于酶原液，但明显高于空白对照；而G带的诱导率无明显差异．此外，用限制性内切酶HaeⅢ和HinfI及其缓冲液处理中国小型白兔外周血染色体标本，也诱导出了相应的类C和G带．