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常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排
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《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期39-39,共1页
一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体... 一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。 展开更多
关键词 小写字母 限制性内切 流感嗜血杆菌 DNA聚合 限制 罗马数字 规范编排 略语
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限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变
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作者 周翠兰 陈婕 +2 位作者 许云思 付乙人 彭翠英 《中南医学科学杂志》 CAS 2024年第1期26-30,共5页
目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将... 目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。 展开更多
关键词 限制性内切KRAS基因 蓝白斑技术 去磷酸化 稀有突变
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鱼类基因组结构研究——Ⅰ.染色体的限制性内切酶显带 被引量:11
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作者 任修海 余其兴 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1991年第1期17-22,共6页
本文报道了1种新的鱼类染色体研究方法——限制性内切酶显带技术。我们应用限制性内切酶Bsp631等分别对黄鳝和长春鳊的染色体进行显带处理,结果表明,Bsp631能使这两种鱼的染色体发生稳定的带纹分化:适度的处理产生多重的G-带状带型,而... 本文报道了1种新的鱼类染色体研究方法——限制性内切酶显带技术。我们应用限制性内切酶Bsp631等分别对黄鳝和长春鳊的染色体进行显带处理,结果表明,Bsp631能使这两种鱼的染色体发生稳定的带纹分化:适度的处理产生多重的G-带状带型,而过度的处理则产生特殊的限制性内切酶抗性带型。根据显带结果分析,我们对鱼类染色体限制性内切酶显带的可行性和实用价值进行了讨论。 展开更多
关键词 限制性内切 染色体带 基因组
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限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺 被引量:1
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作者 张巧 叶贤龙 +3 位作者 任桂萍 张楠 李璐 李德山 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期102-109,共8页
目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠... 目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶NotⅠ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶EagⅠM(EagⅠmethylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶NotⅠR(NotⅠrestriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT7上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-EagⅠM的ER2566中,构建成NotⅠ蛋白表达菌ER2566[pBR322-EagⅠM,pACYC184-PT7-NotⅠR]。重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶NotⅠ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300GL分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后NotⅠ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×106U/mg,提纯35倍,得率为17.8%,产量达9.8×106 Units/g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。 展开更多
关键词 限制性内切酶not I 克隆 表达 纯化
原文传递
限制性内切酶SmaⅠ和HincⅡ存在切割序列多态性 被引量:1
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作者 卢一凡 邓继先 +1 位作者 肖成祖 马清钧 《生物技术通报》 CAS CSCD 1997年第2期18-21,共4页
PCR扩增产物基因组G—CSF基因被克隆至pUC19,在对其进行序列分析时发现,Sma Ⅰ和HincⅡ共同使用对回收片段进行亚克隆时,有一段序列缺失,序列分析表明这可能是由于Sma Ⅰ和Hinc Ⅱ同时使用造成的。S... PCR扩增产物基因组G—CSF基因被克隆至pUC19,在对其进行序列分析时发现,Sma Ⅰ和HincⅡ共同使用对回收片段进行亚克隆时,有一段序列缺失,序列分析表明这可能是由于Sma Ⅰ和Hinc Ⅱ同时使用造成的。Sma Ⅰ和Hinc Ⅱ可能存在切割序列多态性。 展开更多
关键词 限制性内切 Sma HincⅡ 割序列多态性 PCR
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限制性内切酶MluⅠ基因的合成、克隆和初步表达 被引量:1
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作者 覃鸿妮 钱莉春 +1 位作者 沈晓燕 梅啸 《西南师范大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2016年第10期46-53,共8页
在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表... 在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成PUC19-M.MluⅠ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和PUC19-M.MluⅠ转入T7expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考. 展开更多
关键词 限制性内切 Mlu基因的合成 基因克隆 基因表达
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两步亲和层析纯化限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ 被引量:1
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作者 姜怀春 邹国林 +1 位作者 黄宁悟 朱汝潘 《西南师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2000年第1期74-77,共4页
以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA ... 以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA -Speharose 4B两种亲和吸附剂制作方法的改进 . 展开更多
关键词 限制性核酸内切 亲和层析 工具
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常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排 被引量:1
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《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期477-477,共1页
一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体... 一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。 展开更多
关键词 小写字母 限制性内切 流感嗜血杆菌 DNA聚合 限制 罗马数字 规范编排 略语
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限制性内切酶的无细胞快速制备研究
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作者 刘晚秋 季向阳 +2 位作者 许慧玲 卢屹聪 李健 《合成生物学》 CSCD 2023年第4期840-851,共12页
限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵... 限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×10^(5)~3.7×10^(6)U/mg,BamHⅠ8.3×10^(2)~4.1×10^(3)U/mg,BsaⅠ4.4×10^(5)~4.4×10^(6)U/mg)的目标蛋白。同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1~2 d)、蛋白产量高(32.5~130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×10^(5)~5.7×10^(8)U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。 展开更多
关键词 限制性内切 无细胞蛋白合成 蛋白制备 活检测 合成生物学
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Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究
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作者 谭和平 沈兴中 +2 位作者 唐祥凯 王智 叶德萍 《中国测试》 CAS 北大核心 2012年第3期49-51,共3页
非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对... 非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。 展开更多
关键词 限制性内切 非特异性核酸内切 EcoR I PST I
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常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排
11
《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期864-864,共1页
一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体... 一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。 展开更多
关键词 限制性内切 DNA聚合 罗马数字 限制 规范编排 略语 先后次序 字母
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基于识别重叠序列特性的限制性内切酶的重组表达策略研究
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作者 王睿君 龚雪梅 +3 位作者 王欣竹 叶佳琪 李梦磊 张坤晓 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期82-89,共8页
甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略... 甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略:通过共表达识别重叠序列的甲基转移酶来保护宿主菌株,以制备限制性内切酶。首先将识别重叠序列的甲基转移酶转入大肠杆菌ER2566,以保护宿主基因组DNA,然后将能识别重叠序列的多个限制性内切酶分别转入该宿主菌株,以进行限制性内切酶的重组表达,即“一对多”的重组表达模式。根据这一方法,利用甲基转移酶M.Esa Dix5 I、M.Alu I和M.Hha I实现了识别重叠序列(TTAA、AGCT和GCGC)的一系列限制性内切酶的重组表达,还利用甲基转移酶M.Alu I成功实现了两个新的R.Sac I同裂酶R.Eco SP4ORF25090P和R.Gma5ORF28P的重组表达。该方法简化了对抵抗限制性内切酶消化的宿主菌株的大量筛选工作,并提供了大规模制备限制性内切酶的能力。这一方法也可用于发现其他微生物中新的同工酶或同裂酶。 展开更多
关键词 限制性内切 甲基转移 重叠序列 同裂 同工
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限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析
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作者 方倩倩 陈浩 +1 位作者 廖馨源 林忠辉 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期259-268,共10页
限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于As... 限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。 展开更多
关键词 限制性核酸内切 Asc I 表达纯化 学性质 小角散射
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限制性内切酶Bsa I的分离纯化与结晶及其硒代衍生物的制备
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作者 朱海 郑梦泽 +6 位作者 贾玮玮 周倩 谈帅 刘子昂 张传志 王伟玲 李婷婷 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第22期110-116,共7页
目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层... 目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化。然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况,并对其进行酶活测定。最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究。结果:通过两步纯化方法获得了纯度大于90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白;经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的11个甲硫氨酸全部硒代,圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响。结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇8000的条件下生长出颗粒状结晶,而且可以在pH4.6的0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体。结论:本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达,并对蛋白晶体条件进行初筛,旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考。 展开更多
关键词 限制性内切 表达纯化 硒代 结晶
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限制性核酸内切酶PstⅠ活性基团的研究
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作者 刘隽 高成卓 邹国林 《河南科学》 2009年第9期1077-1081,共5页
分别以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸、精氨酸残基和羧基对PstⅠ活性的影响.结果表明,NBS的修饰虽可导致PstⅠ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非... 分别以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸、精氨酸残基和羧基对PstⅠ活性的影响.结果表明,NBS的修饰虽可导致PstⅠ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非PstⅠ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和PstⅠ*活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是PstⅠ的活性基团. 展开更多
关键词 Ⅱ型限制性核酸内切 活性基团 化学修饰 动力学
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利用CpG DNA甲基化酶M.SssⅠ共表达载体制备限制性内切酶NotⅠ 被引量:2
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作者 王佩 陈凯 高嵩 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期51-58,共8页
限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表... 限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达NotⅠ限制酶,采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.SssⅠ特异性甲基化CpG序列,甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶NotⅠ的切割。将甲基化酶M.SssⅠ导入大肠杆菌表达宿主ER2566后,M.SssⅠ基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式;利用此表达体系制备限制性内切酶NotⅠ获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化,制备了高活力高纯度的重组限制酶NotⅠ。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。 展开更多
关键词 重组蛋白表达 限制性内切 甲基化
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限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切条件的优化 被引量:2
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作者 朱杭飞 姜晓明 +4 位作者 藏雨轩 张雲乔 向国艳 张中新 郝峰 《吉林医药学院学报》 2014年第4期250-253,共4页
目的探讨KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。方法 KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切体系,酶切含有上述两种限制性内切酶酶切位点的载体pEGFP-Ano2,DNA琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,以获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。结果 50μL酶切体系,KpnⅠ... 目的探讨KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。方法 KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切体系,酶切含有上述两种限制性内切酶酶切位点的载体pEGFP-Ano2,DNA琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,以获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。结果 50μL酶切体系,KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的适宜条件:首先在1×L缓冲液情况下,应用1μL KpnⅠ酶切1μg质粒1 h,再加入1×H缓冲液和0.01%BSA,应用1μL EcoRⅠ继续酶切1 h。结论获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒的适宜条件,为今后应用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切实验提供科学的参考依据。 展开更多
关键词 Kpn EcoR 优化 DNA琼脂糖凝胶电泳
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黄鳝二价体上微量DNaseⅠ敏感性和限制性内切酶原位切割分析
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作者 杜丽萍 余其兴 +3 位作者 周荣家 崔建勋 郭一清 赵则春 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1998年第4期308-314,共7页
采用DNase Ⅰ超敏感性分析和限制性内切酶介导的原位切口平移技术(Restriction Enzyme Nick Translation,RE-NT)对黄鳝二价体基因组结构进行了分析研究。已知DNaseⅠ超敏感性与潜在活性基因分布密切相关。结果表明,经DNaseⅠ介导的原位... 采用DNase Ⅰ超敏感性分析和限制性内切酶介导的原位切口平移技术(Restriction Enzyme Nick Translation,RE-NT)对黄鳝二价体基因组结构进行了分析研究。已知DNaseⅠ超敏感性与潜在活性基因分布密切相关。结果表明,经DNaseⅠ介导的原位切口平移处理,在黄鳍二价体上可展现类D带带型,而由限制性内切酶介导的原位切口平移结果显示,AluⅠ和MspⅠ均在黄鳝二价体上诱导产生类G带带型,HpaⅡ和HaeⅢ则优先切割5号二价体上一特定区域,诱导出一段由标记信号所构成的类C带,对上述结果进行了分析和讨论。 展开更多
关键词 原位口平移 DNASEI 限制性内切 黄鳝 二价体
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限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选 被引量:2
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作者 程艺 马超 +5 位作者 陈晓雨 邵钰晨 王潇 杨雪丽 苏蓉 李婷婷 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期81-88,共8页
来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获... 来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度>95%的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础。 展开更多
关键词 限制性内切 Nco 表达纯化 硒代 结晶
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限制性内切酶BglⅠ和BglⅡ的提纯比较
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作者 张静娟 马德钦 汪大受 《微生物学通报》 CAS 1982年第2期86-89,共4页
Ⅱ类限制性内切酶BglⅠ和BglⅡ产自圆球芽孢杆菌(Bacillus globigii)。对它们的提纯,已有报道。我们采用只产BglⅠ及同时产BglⅠ及BglⅡ的菌株作为实验材料。
关键词 琼脂糖凝胶 肝素 色谱试剂 蛋白多糖 限制性 凝胶柱 缓冲液 Bgl 汽巴蓝 内切 磷酸纤维素 柱色谱分离
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