限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。

CAR－bacillus菌亚单位核糖核酸RNA限制性内切酶图谱的研究

利用生物体中编码亚单位核糖核酸ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ，ＳＳＵｒＲＮＡ）的ＤＮＡ序列为引物，经ＰＣＲ法扩增到ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓ的大约１．５ｋｂ的ＳＳＵｒＲＮＡ序列，采用ＨｉｎｄⅡ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４，ＨａｅⅢ和ｘｈｏⅠ等５种限制性内切酶进行酶切电泳分析，同时比较了来源于小鼠的ＣＢＭ株及来源于大鼠的ＣＢＲ株，未发现两者有差异。

人类疱疹病毒6型（HHV－6）分离株DNA限制性核酸内切酶酶切图谱分析研究

人类疱疹病毒６型（ＨＨＶ—６）是１９８６年新发现的疱疹病毒。限制性核酸内切酶切图谱分析表明：ＨＨＶ－６不同株之间ＤＮＡ酶切图谱呈多态性。根据酶切图谱的不同，将ＨＨＶ－６分离株分为Ａ、Ｂ二组，Ｂ组又分为Ⅰ、Ⅱ两个亚组。

四种禽源支原体核酸限制性酶切图谱分析

以ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ酶解四种禽源支原体基因组ＤＮＡ所获得的片段用琼脂糖凝胶进行电泳。结果表明，四种禽源支原体基因组ＤＮＡ经上述酶切后所获得的片段图谱有很大的差异性，表明它们之间的相关性很小；８个鸡毒支原体菌株ＤＮＡ经酶切、电泳后所获得的片段亦具有相对的差异性，说明酶切图谱分析不适用于禽类支原体种的鉴定。由于该技术有很高的分辨率，可以区分同种不同株之间的基因差异，因此，这种技术对禽类支原体病流行病学研究很有意义，并为今后禽源支原体分子生物学研究打下了基础。

福建两个蛋鸭品种和常见野鸭线粒体DNA(mtDNA)限制性酶切图谱的比较

用７种限制性内切酶（ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｏｃＲⅤ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｂａⅠ）分析了蛋鸭（金定鸭、莆田黑鸭）、野鸭（斑嘴鸭、绿头鸭）的ｍｔＤＮＡ限制性类型，并用双酶法构建了以上鸭类的ｍｔＤＮＡ限制性酶切图谱．结果表明，蛋鸭与野鸭在ｍｔＤＮＡ结构上发生了明显分岐．比较两种野鸭和金定鸭的图谱，发现金定鸭与绿头鸭的亲缘关系较近．

泥鳅线粒体DNA限制性酶切图谱

对鱼类线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）限制性内切酶图谱分析，有利于进行鱼类种间和种内遗传变异及进化的研究（张亚平等，１９９２）。目前国内外对鱼类的ｍｔＤＮＡ研究已有一些报道（陈关君等，１９８４；戴建华等，１９９４；Ａｖｉｓｅ等，１９８７；Ｂｒｏｗｎ，１９８...

云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体DNA限制性内切酶图谱的研究

云南小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｅＫｉｎｇ）和西藏半野生小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｓｓｐ．ｔｉｂｅｔａｎｕｍＳｈａｏ）是我国西部地区特有的两个普通小麦（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）亚种。我们采用改进的高离子强度法，提取云南小麦、西藏半野生小麦、普通小麦的两个品种（中国春和鄂恩１号）的叶绿体ＤＮＡ，并用７种限制性内切酶对它们的叶绿体ＤＮＡ进行了酶切图谱分析。结果表明：在普通小麦及其两个亚种中没有叶绿体ＤＮＡ的限制性片段长度差异，反映了叶绿体基因组在进化过程中相对的稳定性。

中国昆明(KM)小鼠线粒体DNA限制性内切酶图谱的研究

线粒体DNA的限制性内切酶图谱在不同的种系及亚种间存在多态性。我们分别用五种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅡ、HidⅢ、PstⅠ、MspⅠ对60只中国KM小鼠(雌雄各半)的线粒体DNA进行了酶切电泳分析,结果未发现多态性,且这五种限制性内切酶图谱均与BALB/c小鼠相同。这表明中国KM小鼠与绝大多数实验小鼠一样,均起源于欧州的野鼠M.m.domesticu。未见到KM小鼠经其它亚种野鼠母系遗传污染的迹象。

青鱼线粒体DNA限制性酶切图谱的研究

用10种限制性内切酶对青鱼(Mylopharyngodonpiceus)的肝脏mtDNA进行了分析,其分子质量为9 949×106u,分子大小约为16 60kb.PstⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、XbaⅠ、BglⅡ、BglⅠ在青鱼的mtDNA分子上分别具有0、3、1、4、4、3、2、2、2、3个切点.根据单酶解及双酶解结果建立了青鱼mtDNA的限制性酶切图谱.

丰鲤及其双亲线粒体DNA限制性酶切图谱的研究

采用密度梯度离心及RNase消化法制备并纯化了丰鲤(Fengcarp)、兴国红鲤(Xingguoredcarp)及散鳞镜鲤(Scatterscaledmirrorcarp)的肝脏线粒体DNA,用10种限制性内切酶HindIII、EcoRI、BamHI、XbaI、XhoI、PstI、BglII、SalI、BglI、PvuII进行了分析.丰鲤mtDNA相对分子质量约为9 88×106,大小约为16 49kb;兴国红鲤mtDNA相对分子质量约为9 89×106,大小约为16 50kb;散鳞镜鲤mtDNA相对分子质量约为9 87×106,大小为16 48kb.HindIII、EcoRI、BglI、BamHI、XbaI、XhoI、SalI、BglII、PstI及PvuII在丰鲤、兴国红鲤、散鳞镜鲤线粒体DNA分子上均分别有6、4、3、3、3、1、1、0、1和4个切点.根据单酶切及双酶切结果,构建了丰鲤、兴国红鲤、散鳞镜鲤mtDNA9种酶的限制性酶切图谱,结果表明丰鲤、兴国红鲤及散鳞镜鲤mtDNA间缺乏变异性.

大黄鱼线粒体DNA的限制性内切酶图谱

从大黄鱼（Pseudosciaena crocea）肝脏中提取线粒体DNA（mtDNA）。用限制性核酸内切酶酶切后，得到酶切图谱。以1 kb ladder作为相对分子量标准。以电泳迁移率为纵坐标，分子量的对数值为横坐标作标准图，利用电泳迁移率与分子量的对数值的线性关系，计算出各酶切片段的分子量，并推算出大黄鱼mtDNA分子量为27．33×10^6D，大小为16．891kb左右。根据单酶切和双酶切的数据，以及mtDNA是环状分子等特征，建立了大黄鱼的mtDNA酶切图谱。

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)的限制性核酸内切酶分析

目的 以我国特有的多重耐药伤寒沙门菌中分离的质粒pRST98为研究对象 ,对其除编码细菌抗药性外还能使宿主菌毒力增强这一独特性状产生的分子基础 ,用限制性核酸内切酶进行核酸酶谱分析。方法 将质粒pRST98用QIAGEN试剂盒提纯并精确定量后 ,选用常用的 9种限制性核酸内切酶消化 ,制作该质粒的酶切图谱。结果 用试剂盒提纯质粒 ,再用限制性内切酶消化后得到了清晰、准确的质粒酶切图谱 ,其中BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ和SacⅡ是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具。结论 伤寒沙门菌多效性质粒 pRST98限制性核酸内切酶谱的建立 ,为分析该质粒的遗传特征、流行病学追踪和基因功能定位奠定了基础。

两步亲和层析纯化限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ

以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA -Speharose 4B两种亲和吸附剂制作方法的改进 .

Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。

沈阳地区肺炎支原体分离株P1蛋白基因限制性酶切图谱分型研究

目的 :根据肺炎支原体 (MP)P1蛋白基因限制性酶切图谱分类MP临床分离株 ,调查沈阳地区肺炎支原体流行情况。方法 :多聚酶链反应扩增MPFH标准株和MP临床分离株的P1基因片段 ,扩增产物用限制性内切酶HeaIII消化 ,1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析。结果 :肺炎支原体临床分离株和FH标准株酶切图谱相同。结论 :沈阳地区肺炎支原体分离株属于Ⅱ型。

大鳞副泥鳅线粒体DNA九种限制性内切酶酶切图谱

大鳞副泥鳅ｍｔＤＮＡ经１１种限制性内切酶（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩ，ＢｇｌⅡ，ＥｃｏＲＩ，ＨｐａＩ，ＫｐｎＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＸｂａＩ和ＸｈｏＩ）单酶完全酶解获得２３个酶切位点，这些酶酶切位点数依次分别是：２、７、０、３、３、０、３、１、１、２和１。通过琼脂糖凝胶电泳测定大鳞副泥鳅ｍｔＤＮＡ平均分子量为１０．３３±０．２２×１０６ｕ（原子质量）；其分子长约１６７２０±３５０碱基对（ｂｐ）。采用双酶完全酶解法构建了大鳞副泥鳅ｍｔＤＮＡ限制性内切酶酶切图谱。

从喜温蓝藻分离热稳定限制性内切核酸酶

从喜温蓝藻ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＴ３分离出一种限制性内切核酸酶，命名为ＳｅｌＩ．此酶是限制性内切核酸酶Ｓａｕ９６Ｉ的同切酶，它们的识别序列ＧＧＮＣＣ．但是ＳｅｌＩ的反应条件与Ｓａｕ９６Ｉ不同．ＳｅｌＩ是一种热稳定的限制性内切核酸酶。

限制性核酸内切酶PstⅠ活性基团的研究

分别以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸、精氨酸残基和羧基对PstⅠ活性的影响.结果表明,NBS的修饰虽可导致PstⅠ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非PstⅠ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和PstⅠ*活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是PstⅠ的活性基团.

四种昆虫病毒基因组DNA限制性内切酶图谱分析

应用限制性内切酶图谱分析．结合 ＤＮＡ单分子层和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法，对黄地老虎颗粒体病毒（ＡｓＧＶ），甘兰莱粉蝶颗粒体病毒（ｐｈＧＶ），三叶草夜蛾颗粒体病毒（ＳｔＧＶ）和荨麻蛱蝶核型多角体病毒（ＡｕＮＰＶ）等四种杆状病毒提取基因组ＤＮＡ用９处限制性内切酶酶切，得到不同的酶切图谱使其在基因型上进行区分，通过ＤＮＡ单分子展层发现其核酸链都呈闭环和超螺旋构刑，用３２Ｐ标记ＡｕＮＰＶ与ＧＶ杂交，没有发现与ＧＶ的同源性。