限制性核酸内切酶的制备、纯度鉴定和测活方法

限制性核酸内切酶(简称限制酶)主要来源于细菌,其分布广泛、种类繁多。第一个限制酶于1968年问世,迄今已发现了近500种,其中绝大部分是Ⅱ型限制酶。Ⅱ型酶是非常重要的工具酶,被誉为“分子手术刀”;也为研究两类最重要的生物大分子——蛋白质和核酸的相互作用提供了一个理想的模型。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

琼脂糖凝胶电泳的条件优化——质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定

随着质粒构建,转染,扩增等基因表达相关的分子生物学技术在科研中的广泛开展,DNA的琼脂糖凝胶电泳技术由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定生物大分子（核酸）的重要手段和常用方法。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素很多,包括DNA分子大小和构象,琼脂糖浓度,所加电压,电泳缓冲液的离子浓度,

利用针对16S rDNA序列的限制性酶切分析鉴定栖热菌属

目的:建立一套酶切体系,用于鉴定栖热菌。方法:收集和整理栖热菌属16S rDNA序列信息,利用限制性内切酶对信息进行位点分析。结果:建立了一套鉴定栖热菌的酶切体系,通过模拟电泳对该体系进行验证。结论:该系统可有效地对已经公开发表但未鉴定到种的栖热菌属菌株进行种间分类。

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)的限制性核酸内切酶分析

目的 以我国特有的多重耐药伤寒沙门菌中分离的质粒pRST98为研究对象 ,对其除编码细菌抗药性外还能使宿主菌毒力增强这一独特性状产生的分子基础 ,用限制性核酸内切酶进行核酸酶谱分析。方法 将质粒pRST98用QIAGEN试剂盒提纯并精确定量后 ,选用常用的 9种限制性核酸内切酶消化 ,制作该质粒的酶切图谱。结果 用试剂盒提纯质粒 ,再用限制性内切酶消化后得到了清晰、准确的质粒酶切图谱 ,其中BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ和SacⅡ是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具。结论 伤寒沙门菌多效性质粒 pRST98限制性核酸内切酶谱的建立 ,为分析该质粒的遗传特征、流行病学追踪和基因功能定位奠定了基础。

两步亲和层析纯化限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ

以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA -Speharose 4B两种亲和吸附剂制作方法的改进 .

Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。

从喜温蓝藻分离热稳定限制性内切核酸酶

从喜温蓝藻ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＴ３分离出一种限制性内切核酸酶，命名为ＳｅｌＩ．此酶是限制性内切核酸酶Ｓａｕ９６Ｉ的同切酶，它们的识别序列ＧＧＮＣＣ．但是ＳｅｌＩ的反应条件与Ｓａｕ９６Ｉ不同．ＳｅｌＩ是一种热稳定的限制性内切核酸酶。

PCR和限制性内切酶在uPA-SCID小鼠基因型鉴定中的应用

目的 建立一种简便、快捷、准确的基因型鉴定方法用于uPA-SCID小鼠的基因型鉴定.方法 应用PCR技术与限制性内切酶相结合的方法检测uPA-SCID小鼠的基因型.结果 uPASCID小鼠的uPA基因型鉴定结果显示：uPA基因野生型在153 bp有条带,纯合子在337 bp有条带,杂合子在337bp、153bp有条带.uPA-SCID小鼠的SCID基因型鉴定结果显示：uPA-SCID小鼠SCID基因突变体在38 bp、26 bp有条带,杂合子在64 bp、38 bp、26 bp有条带,野生型在64 bp有条带.结论 建立的基因型鉴定方法简便易行、可靠,通过该方法可以确定uPA-SCID小鼠的基因型,筛选出需要的纯合子uPA-SCID小鼠.

限制性核酸内切酶PstⅠ活性基团的研究

分别以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸、精氨酸残基和羧基对PstⅠ活性的影响.结果表明,NBS的修饰虽可导致PstⅠ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非PstⅠ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和PstⅠ*活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是PstⅠ的活性基团.

限制性核酸内切酶Bsp63I的部分性质研究及与其同工酶的比较

纯化至电泳均一纯的限制性核酸内切酶Bsp6 3I经SephadexG - 2 0 0测得相对分子质量约为 113 80 0 ,SDS-聚丙烯酰凝胶电泳测得其亚基相对分子质量约为 5 6 80 0 .用DNS法测得该酶N -末端氨基酸为丙氨酸 ,表明该酶由 2个相同的亚基组成 ,还对Bsp6

识别序列外DNA甲基化对限制性核酸内切酶PvuⅡ酶切活性影响的研究

构建了重组质粒ｐＳＶ２ｇｐｔ－ＳＶ４０ｏｒｉ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ｒａｓ（简称Ｐ１），利用这一重组体进一步证实了识别序列外ＤＮＡ甲基化对限制性核酸内切酶ＰｖｕⅡ切割活性的抑制作用，并对这一抑制作用进行了定量研究。结果表明：邻近ＰｖｕⅡ识别位，点的ＤＮＡ甲基化可降低ＰｖｕⅡ对该位点酶切活性的７０％左右。

CAR－bacillus菌亚单位核糖核酸RNA限制性内切酶图谱的研究

利用生物体中编码亚单位核糖核酸ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ，ＳＳＵｒＲＮＡ）的ＤＮＡ序列为引物，经ＰＣＲ法扩增到ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓ的大约１．５ｋｂ的ＳＳＵｒＲＮＡ序列，采用ＨｉｎｄⅡ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４，ＨａｅⅢ和ｘｈｏⅠ等５种限制性内切酶进行酶切电泳分析，同时比较了来源于小鼠的ＣＢＭ株及来源于大鼠的ＣＢＲ株，未发现两者有差异。

牛摩拉氏菌中国地方株限制性核酸内切酶的提取与纯化

目的 :为探讨牛摩拉氏菌中国地方株MABL80 11限制酶的存在。方法 :采用改进的GelinasRE等方法对MABL80 11菌株的培养物分别进行超声裂解、离心、盐析、BioGel A0 .5M和磷酸纤维素P11柱层析 ,获得可切割λDNA和pBR332DNA与国际标准酶MboI切点一致的酶提取物。结果 :在改进的条件下 ,30 0 0ml培养物 ,可获得 72 0 0UMboI,纯化率为 2 3.2 % ,酶产出量高于文献报导值。结论 :表明牛摩拉氏菌中国地方株MABL80 11确含MboI限制性内切酶 。

人类疱疹病毒6型（HHV－6）分离株DNA限制性核酸内切酶酶切图谱分析研究

人类疱疹病毒６型（ＨＨＶ—６）是１９８６年新发现的疱疹病毒。限制性核酸内切酶切图谱分析表明：ＨＨＶ－６不同株之间ＤＮＡ酶切图谱呈多态性。根据酶切图谱的不同，将ＨＨＶ－６分离株分为Ａ、Ｂ二组，Ｂ组又分为Ⅰ、Ⅱ两个亚组。

用限制性内切酶多态性分析23SrRNA快速鉴定李斯特菌种

目的为快速鉴定六种李斯特菌。方法用 PCR 扩增六种参考李斯特菌23SrRNA 基因片段 S_1、S_2,再用限制性内切酶 S_1、S_2,用 API 反应条同时做生化反应。结果 S_2用 XmnI 或 CfoI 酶切,S_2用 AluI 或 ClaI 酶切,可以分别鉴定出这六种参考李斯特菌,结果与 API 反应条一致。结论 PCR-RFLP 能快速、方便地用于李斯特菌的鉴定,且方法可靠、实用,可应用于食品和环境微生物的鉴定。

四种禽源支原体核酸限制性酶切图谱分析

以ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ酶解四种禽源支原体基因组ＤＮＡ所获得的片段用琼脂糖凝胶进行电泳。结果表明，四种禽源支原体基因组ＤＮＡ经上述酶切后所获得的片段图谱有很大的差异性，表明它们之间的相关性很小；８个鸡毒支原体菌株ＤＮＡ经酶切、电泳后所获得的片段亦具有相对的差异性，说明酶切图谱分析不适用于禽类支原体种的鉴定。由于该技术有很高的分辨率，可以区分同种不同株之间的基因差异，因此，这种技术对禽类支原体病流行病学研究很有意义，并为今后禽源支原体分子生物学研究打下了基础。

限制性核酸内切酶与DNA相互作用研究进展

蛋白质对ＤＮＡ识别的模体中，除了锌指结构、螺旋—转角—螺旋、亮氨酸拉链和β带外，近年来发现，Ⅱ型限制性内切酶与ＤＮＡ作用的模体有许多特别之处。通过对ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ等与ＤＮＡ复合物的空间构象、一级结构分析，发现酶分子存在催化性裂缝，并且氨基端形成臂结构包绕ＤＮＡ；同时ＤＮＡ发生构象变化、螺旋扭结。这些有趣的结构有利于酶对底物的特异性结合和催化作用。

限制性核酸内切酶及其显带研究进展

介绍了核酸内切酶及其在基因工程中的应用,综述了人染色体、其它生物染色体显带概况,并对内切酶的显带机理进行了探讨.

一步法分离纯化限制性核酸内切酶BamHI

本文提出了一个迅速简便纯化BamHI的方法,即一步肝素——琼脂糖亲和层析法。