聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD基因序列变异

目的建立检测基因变异的聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymophism,RFLP)法。方法从服用拉米夫定1年以上的慢性乙肝病例中选取10例抽取血清,分别采用错配套式PCR-RFLP技术、PCR产物直接测序和重组克隆测序,检测P基因YMDD变异。结果在10个病例中,PCR-RFLP检测到7例为野毒株、1例为混合株感染、2例为变异株;PCR产物直接测序,9例为野株、1例为变异株;对2份用PCR-RFLP法检测为非野株,而PCR测序为阴性的标本采用克隆后测序,发现均为混合株感染。结论通过对几种检测方法的对比,认为克隆后测序的结果最精确;而从实用性和经济角度来看,采用PCR-RFLP进行初步筛检的方法具有更大的意义,值得推广。

应用限制性片段长度多态性分析技术研究乙醇脱氢酶2的基因多态型

分子遗传学技术的发展使得我们对与遗传有关疾病的认识达到了新的境界。通过产前对个体所携有的基因多态型的研究可以对某些疾病进行早期预测，从而达到预防、优生优育的目的。酒精脱氢酶２基因就是一个鲜明的例子，个体带有的基因型不同其表现型也不同，它与胎儿酒精综合征、胎儿酒精效应及酒精相关疾病存在着一定联系。为此本文采用限制性片段长度多态性分析技术研究酒精脱氢酶２的基因，根据基因的变化。

ABO位点限制性扩增片段长度多态性的研究

建立了PCR扩增、限制性酶切、8％（T）、5％（C）聚丙烯酸胺凝胶垂直电泳和银染检测ABO位点的限制性片段长度多态性的方法体系。应用Amp-RFLP技术对185名中国人（哈尔滨）ABO位点的基因频率和基因型分布进行了调查和统计分析。ABO位点特异片段长度为140～200bp，基因频率为0．2000～0．5568。6种基因型频率为0．973～0．3135，杂合度0．5838，Dp值0．7146。经H－W平衡吻合度检测，完全符合群体遗传多态分布。通过对11个家庭33名相关个体的分析，证明完全符合孟德尔遗传定律。ABO基因型检验适用于法庭科学的个体识别和亲权鉴定。

几个种子公司引进限制酶片段长度多型性技术

英国的农业遗传学公司(Agricultural Genetics Co.,AGC;在剑桥)与几个大种子公司签订了许可证协议,同意它们应用它的限制酶片段长度多型性(RFLP)技术,对小麦和大麦进行遗传标记。RFLP 技术虽然是英国农业和食品研究委员会的植物科学研究所(在剑桥)

不同年龄不同组织中的端粒限制性片断长度测定的意义

目的 探讨端粒长度与高等真核细胞生物中正常体细胞增殖能力间的关系。方法 以不同年龄的正常腮腺组织及正常皮肤表皮组织做标本 ,利用Southern杂交方法测定每份标本的端粒限制性片段长度 ,然后比较同一组织不同年龄的端粒限制性片段长度 ,并进行统计学分析。结果 同一年龄不同组织的端粒限制性片段长度是不同的。皮肤表皮的端粒限制性片段长度平均值随年龄增长而变短 ;腮腺组织的端粒限制性片段长度平均值未随年龄增长而变短。结论 端粒缩短是细胞复制性衰老的主要原因。在不同的组织中 。

中国弓形虫分离株基因型及致病性的研究进展

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种广泛寄生于人和恒温动物体内的原虫,有着复杂的生活史和致病机制。近年来关于弓形虫种群结构的研究表明其具有遗传多样性和地域差异性。目前,已从全球分离到1 457个弓形虫虫株,确定了189个基因型(http://ToxoDB.org),其中南美的基因型具有高度的遗传多样性,关于我国流行的弓形虫虫株基因型及致病性的研究尚十分有限。本文总结了我国弓形虫分离虫株的基因型及特点,以期为深入研究中国弓形虫种群结构、流行病学及致病机制提供有力依据。

维生素D受体基因多态性与2型糖尿病发病的关联

目的:比较南京地区汉族人群中2型糖尿病患者与健康者之间维生素D受体基因限制性内切酶BsmⅠ位点等位基因频率和基因型频率分布的差异,分析维生素D受体基因多态性与2型糖尿病的关系。方法:①选择2001-09/2003-03南京医科大学第二附属医院内分泌科门诊就诊的2型糖尿病患者106例为糖尿病组,男45例,女61例。均符合1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准。选择同期本院健康体检者102人为对照组,男42人,女60人。纳入对象均对实验目的知情同意。②采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法检测两组对象维生素D受体基因限制性内切酶BsmⅠ位点等位基因和基因型。计算维生素D受体基因等位基因频率和基因型频率,计量资料的比较用t检验,等位基因频率和基因型频率分布比较采用χ2检验。采用多因素非条件Logistic回归分析对维生素D受体基因BsmⅠ位点多态性与2型糖尿病的关系。结果:糖尿病患者106例和健康体检者102人均进入结果分析。①南京地区汉族人群中维生素D受体基因BsmⅠ酶切位点有2种等位基因B,b;存在3种基因型BB,Bb,bb。②维生素D受体基因BsmⅠ位点等位基因b,B频率在糖尿病组和对照组中的分布差异明显[糖尿病:39.6%,60.4%;对照组19.6%,80.4%,χ2=19.90,P<0.01],两组间基因型bb,Bb,BB的分布差异明显[糖尿病:17.9%,43.4%,38.7%;对照组5.9%,27.4%,66.7%,χ2=17.76,P<0.01]。等位基因b与2型糖尿病患病有显著关联(RR=2.7,P<0.05)。③多因素非条件Logistic回归分析结果显示,等位基因b是2型糖尿病的易感基因(P=0.01,OR=2.218,OR95%CI:1.99～3.778),而等位基因B对2型糖尿病具有保护作用(P=0.049,OR=0.359,OR95%CI:0.129～0.999)。结论:南京地区汉族人群中维生素D受体基因BsmⅠ位点多态性与2型糖尿病相关联,等位基因b可能是2型糖尿病的易感基因。

载脂蛋白E基因多态性与不同性别和病因分型脑梗死患者的关系

目的探讨载脂蛋白E(ApoE)基因多态性与不同性别和病因分型脑梗死患者的关系。方法连续纳入≥60岁脑梗死患者91例(脑梗死组)。按低分子肝素治疗急性缺血性卒中试验(TOAST)病因分型法将其分为大动脉粥样硬化型(LAA)卒中37例,小动脉闭塞型(SAO)卒中54例。纳入年龄、性别、居住地区相匹配的健康体检者105名为对照组。采用等位基因特异性多重聚合酶链反应方法检测ApoE基因多态性。比较不同性别、病因分型脑梗死的ApoE基因多态性。结果 (1)共测出E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/3型ApoE基因型,E4/4基因型未测出。(2)脑梗死组与对照组ApoE基因型频率及各基因携带者频率差异均无统计学意义(P均>0.05)。脑梗死组男性与对照组男性的ApoE基因型频率及各基因携带者频率差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),其中脑梗死组男性的E3/3基因型频率(56.1%)、ε3携带者频率(78.0%)均低于男性对照组(分别为79.2%、89.6%);E3/4基因型频率(31.7%)、ε4携带者频率(15.9%)均高于对照组(分别为7.5%、3.8%)。女性受试者两组的ApoE基因型频率及各基因携带者频率差异均无统计学意义(P均>0.05)。(3)LAA亚型、SAO亚型、对照组的ApoE基因型频率和基因携带者频率差异均无统计学意义。男性LAA亚型与对照组比较,ApoE基因型频率和基因携带者频率差异均有统计学意义(P<0.01);LAA的E2/3和E3/3基因型频率(分别为6.7%、46.7%)、ε2及ε3携带者频率(分别为3.3%、73.3%)均低于对照组(分别为13.2%、79.2%,6.6%、89.6%);LAA亚型的E3/4基因型频率、ε4携带者频率分别为46.7%、23.3%,均高于对照组的7.5%、3.8%。但男性SAO组与对照组、女性LAA亚型、SAO亚型、对照组3组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论ε4基因可能是男性患LAA的危险因素。未发现ApoE基因多态性与女性脑梗死有关。

AGT基因单倍型与原发性高血压

选取血管紧张素原 (angiotensinogen ,AGT)基因启动子区 - 2 17,- 15 2 ,- 2 0 ,- 6 ,内含子 1的 +31,第二外显子T174M(3889)和T2 35M(4 0 72 )共 7个位点 ,对 4 97例的样本 (高血压患者 2 98例 ,血压正常对照 199例 )用PCR RFLP和最大期望值 (expectationmaximization ,EM)算法为基础的最大似然法 (maximumlikelihoodestimate ,MLE)检测和估算 ,本群体AGT基因A 6G ,C +31T ,T2 35M 3位点两两存在完全连锁不平衡 (D′ =1) ;G 2 17A和G 15 2A位点 ,G 15 2A和 3889T位点平衡传递。存在 7种单倍型 ,单倍型H2 (- 2 17:A ,- 15 2 :G ,- 2 0 :A ,- 6 :G ,+31:T ,174 :T ,2 35 :M)在正常血压个体中的频率高于高血压组。研究结果提示AGT基因中H2单倍型可能与控制血压的保护性因素连锁不平衡。此外 ,本研究结果支持基因剂量效应可能存在于单倍型中 。

慢性乙型肝炎病毒基因型与干扰素治疗应答的关系

观察慢性乙型肝炎病毒基因型与α -干扰素治疗慢性乙型肝炎患者疗效的关系。利用限制性片段长度多态性分析技术 ,由限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ作用于前S区扩增片段建立的简便的HBV基因型分型方法 ,对 6 0例经干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者的血清HBV进行基因型测定 ,显示B基因型 31例 (5 1 7% ) ,C基因型 2 6(43 3% ) ,D基因型 3例 (5 0 % )。B型、C型与干扰素应答无明显差异 (P >0 0 5 ) ,3例D型均有效。由于我国大部分地区HBV基因型以B型和C型为主 ,HBV基因型可能不是预测干扰素疗效的重要因素。D型对干扰素应答率高 ,有待进一步研究。

新疆维吾尔族乙型肝炎病毒慢性无症状携带者的乙型肝炎病毒基因型测定

目的 :研究新疆维吾尔族乙型肝炎病毒 (HBV)慢性无症状携带者的HBV基因型分布。方法 :利用限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术 ,由限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ作用于HBVDNA前S区扩增片段建立的简便的HBV基因型分型方法 ,对5 2例HBeAg阳性的新疆维吾尔族HBV慢性无症状携带者的HBV进行基因型测定。结果 :D基因型 5 7.7% (30 / 5 2 ) ,C基因型30 .8% (16 / 5 2 ) ,B基因型 11.5 % (6 / 5 2 ) ,无A、E和F型。结论 :新疆维吾尔族HBV慢性无症状携带者的HBV基因型以D型为优势 ,为我国HBV基因型分布提供了新的资料 。

2型糖尿病及胰岛素抵抗与脂蛋白脂酶基因HindⅢ和PvuⅡ酶切位点多态性相关性的研究

目的探讨脂蛋白脂酶基因第8内含子HindⅢ和第6内含子PvuⅡ酶切位点多态性与2型糖尿病及其胰岛素抵抗的发生之间是否有关联。方法选取78例2型糖尿病患者为病例组,49例正常人为正常对照组,分别对第8号内含子HindⅢ酶切位点(H)及第6号内含子PvuⅡ酶切位点(P)进行多态性分析。结果病例组等位基因"H+"和基因型H+H+分布频率分别高于正常对照组(P<0.05)。病例组中并发高甘油三酯血症组等位基因H+和基因型H+H+分布频率均高于正常甘油三酯血症患者组(P<0.05)。病例组中P+P+组高密度脂蛋白胆固醇水平低于P-P-组(P<0.05),而低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素抵抗指数水平高于P-P-组(P<0.05)。结论脂蛋白脂酶HindⅢ酶切位点多态性与2型糖尿病及其胰岛素抵抗有关。PvuⅡ酶切位点多态性与2型糖尿病中胰岛素抵抗有关。

限制性片段长度多态性分析方法应用于中国麻疹野病毒基因型别的鉴定

目的 建立和应用麻疹野病毒基因型快速诊断方法 ,及时监测麻疹流行株基因型动态 ,尽早发现异型输入病例。方法 应用一种适用于我国现流行麻疹野病毒的基因型别筛查、定型的分析方法 ,即逆转录 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性分析方法 (RT PCR RFLP) ,对吉林省 2 0 0 1～ 2 0 0 3年分离到、经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹实验室用脱氧核糖核酸 (DNA)序列分析证实为H1基因型的 9株野病毒进行验证。结果 9株麻疹病毒分离阳性株的RT PCR-RFLP基因分型结果与核酸序列分析结果完全一致 ,均为H1基因型。并应用该方法对吉林省 2 0 0 3年分离的 2株麻疹病毒进行基因型别鉴定 ,亦为H1基因型。同时对 2 0 0 1～ 2 0 0 3年的 46份麻疹病例的临床标本 ,应用新建立的RT-PCR-RFLP方法直接进行麻疹病毒核糖核酸 (RNA)提取、RT-PCR反应及基因型别鉴定。 46例临床标本经直接RT-PCR扩增后的 31例RT-PCR阳性产物 ,经RFLP法酶切、电泳结果均为H1基因型。结论 RFLP分析方法是一种快速、简便又经济实用的中国麻疹野病毒基因定型筛查方法 ,对快速掌握麻疹病毒基因型流行动态及地理分布 ,以及麻疹野病毒的输入、变异情况 。

限制性片段长度多态性分析人血小板抗原5系统基因型

目的 建立人类血小板抗原 (HPA) 5系统限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析方法。方法 采用PCR RFLP方法对 2 5名健康献血员的HPA 5系统进行基因分型。分型结果与采用等位基因特异性寡核苷酸点杂交 (PCR ASO)获得的结果进行比较。结果 以PCR RFLP方法对 2 5名献血员的HPA 5系统分型 :2 4名为a/a型 ,1名为a/b型 ,未发现b/b纯合子个体 ,结果与PCR ASO方法获得的结果完全一致。结论 使用PCR RFLP方法对HPA 5系统进行基因分型 ,具有简便、快速、准确等优点 ,有利于新生儿同种免疫血小板减少性紫癜。

2型糖尿病患者载脂蛋白E基因多态性的研究

目的 探讨中国人 2型糖尿病患者载脂蛋白 E(apo E)基因多态性及其与血脂和载脂蛋白水平的关系。方法 采用聚合酶链反应 -限制性酶切片段长度多态性法 ,分别对 74例 2型糖尿病患者及 191例血脂、血糖正常且无糖尿病史者的 apo E基因型、空腹血脂及载脂蛋白 A 、A 、B10 0、C 、C 及 E进行全面分析。结果 2型糖尿病患者的血清甘油三酯 (TG) ,总胆固醇 (TC) ,低密度脂蛋白胆固醇 (L DL C) ,非高密度脂蛋白胆固醇(n HDL C) ,载脂蛋白 B10 0、C 、C 、E水平及 TG/ HDL C比值较对照组显著升高 (P<0 .0 1) ;血清高密度脂蛋白胆固醇 (HDL C) ,apo E/ apo C 比值显著降低 (P<0 .0 5 )。2型糖尿病组与对照组 apo E基因频率分布无显著性差异(P>0 .0 5 )。携带 ε2 等位基因组血清 TG/ HDL C比值较 E3/ 3基因型显著降低 ;而携带 ε4 等位基因组血清 apo A 水平较 E3/ 3基因型及携带ε2 等位基因组显著升高 (P<0 .0 0 1) )。结论 2型糖尿病患者 apo E基因多态性与血TG/ HDL C及 apo A

内脂素基因多态性与2型糖尿病的关系

目的探讨内脂素(visfatin)rs11977021、rs12537455、rs2110385位点单核苷酸多态性与2型糖尿病易感性的关系。方法收集陕西西安地区汉族人群192例受试对象,其中106例单纯2型糖尿病(T2DM)患者和86例健康对照者,采用标准化的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)方法,分别检测内脂素(visfatin)rs11977021/DdeⅠ、rs12537455/AluⅠ和rs2110385/AluⅠ基因型并进行比较。结果 rs2110385位点的T等位基因频率和GT基因型频率在T2DM组均高于健康对照组(分别为28.3、14.0和14.2、7.0,P均<0.05);两组的rs11977021位点和rs12537455位点C、T等位基因及基因型频率分布均无统计学差异(P>0.05);单倍型分析显示T-C-T和T-T-T单倍型在T2DM组均显著高于健康对照组(分别为0.066、0.026和0.029、0.012,P均<0.05)。结论 Visfatin基因rs2110385位点在陕西西安汉族地区人群中存在遗传变异,其rs2110385多态性位点的T等位基因可能与T2DM的发病风险有一定的关系。

内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与青海省汉族妊娠高血压综合征的相关性

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)G894T基因多态性与青海省汉族妊娠高血压综合征(PIH)的相关性。方法采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法对138名妊娠高血压综合征患者和135名正常孕妇e NOS基因G894T多态性进行分型,并测序验证。结果妊娠高血压综合征组基因型频率野生型(GG)、杂合子型(GT)和突变纯合子型(TT)分别为17.4%、82.6%、0;对照组分别为0、95.6%、4.4%,两组基因型频率分布有差异(P<0.05)。妊娠高血压综合征组e NOS等位基因频率G、T分别为58.7%、41.3%;对照组分别为47.8%、52.2%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),妊娠高血压综合征组G基因频率高于对照组。结论e NOS基因G894T多态性可能与青海省汉族妊娠高血压综合征有关,G等位基因可能为妊娠高血压综合征的易感基因(OR=1.229,95%CI:1.048~1.441),T等位基因可能为妊娠高血压综合征的保护基因。携带GG基因型的孕妇可作为青海省妊娠高血压综合征的易感人群。

TGF-β_1基因T29→C多态性与2型糖尿病肾病的相关性

应用PCR-RFLP技术检测福建地区167例2型糖尿病患者(其中80例合并糖尿病肾病)和62名健康对照者TGF-β1基因T29→C多态性,结果显示,C等位基因可能与糖尿病肾病发病相关。

MMP-9-1562C/T基因多态性与2型糖尿病肾病关系的研究

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)患者基质金属蛋白酶-9基因-1562C/T(MMP-9-1562C/T)多态性与糖尿病肾病(DN)及DN不同病期的关系。方法:将150例T2DM患者按DN诊断标准分为DN组与非糖尿病肾病(NDN)组,DN组分为微量白蛋白尿期、临床白蛋白尿期和肾功能不全期。另择52例健康人作为正常对照(NC)组。应用限制性片段长度多态性(RFLP)分析各组基因型。结果:DN组的糖化血红蛋白(HbA1c)、收缩压(SBP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白排泄率(UAER)值高于NDN、NC组(P<0.01)。DN组与NDN组、NC组之间基因型分布差别均有统计学意义(P<0.01)。T2DM中CC、CT、TT各基因型DN发生率依次递减,其中TT基因型组DN发生率低于CC基因型组(P<0.01)。携T等位基因者发生DN的风险是携C等位基因者的0.47倍(P<0.01,95%CI0.29～0.75)。MMP-9-1562C基因型、HbA1c、TG、TC、Cr、BUN、SBP是DN发生的危险因素;DN组内微量白蛋白尿期、临床白蛋白尿期和肾功能不全期TT基因型与T等位基因频率随肾功能减退而降低(P<0.05或P<0.01)。结论:MMP-9-1562C/T基因多态性与DN发生有关,T等位基因是DN患者的保护基因。