IS6110-限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学中的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果①IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。②将本次实验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。③广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。

单核苷酸多态性与原发性肝癌易感性及临床病理学的相关分析

目的:探讨单核苷酸多态性(SNP)与本地区原发性肝癌(PHC)遗传易感性的关系,并探究SNP位点数目与肝癌患者临床病理学的相关性。方法:采用聚合酶链反应–限制性片段长度多态性技术检测234例肝癌患者和234例阴性对照的27个PHC相关SNP位点基因型和等位基因分布频率,并分析SNP位点与PHC遗传易感性、肝癌患者临床病理学和SNP位点数目的相关性。结果:1) miR-34b/c基因rs4938723位点CC基因型(调整OR = 1.736,95%CI:1.036~2.910,P = 0.036)、EGF基因rs4444903位点GG基因型(调整OR = 1.841,95%CI:1.103~3.071,P = 0.019)具有更高的PHC患病风险;KIF1B基因rs17401966位点GG基因型具有更低的PHC患病风险(调整OR = 0.540,95%CI:0.314~0.930,P = 0.026);分层分析结果显示在男性(P = 0.039)和饮酒(P = 0.025)的人群中EGF基因rs4444903位点基因型GG相比AA + AG基因型PHC发病风险增加;在女性(P = 0.013)、年龄 < 60岁(P = 0.026)及不饮酒(P = 0.039)人群中KIF1B基因rs17401966位点GG基因型相比AA + AG基因型PHC发病风险降低。2) SNP位点数目与门静脉癌栓发生率增加有关(调整OR = 1.122,95%CI:1.005~1.251,P = 0.040)。结论:miR-34b/c基因rs4938723、EGF基因rs4444903、KIF1B基因rs17401966单核苷酸多态性与本地区PHC风险相关,SNP位点数目与肝癌患者临床病理学具有相关性。

IS6110限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110限制性片段长度多态性(IS6110RFLP)和间隔区寡核苷酸分型技术(spoligotyping)两种方法在结核病流行病学上的应用,探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株,分别应用IS6110RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果(1)IS6110RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。(2)将本次试验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型,其中类型1为流行的类型,分布广泛,即所说的北京基因型。(3)广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义(P<0.05)。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效,在中国不同地区的菌株具有不同的特点。

核苷酸内焦磷酸酶磷酸二酯酶1基因K121Q多态性与2型糖尿病的相关性研究

目的探讨中国黑龙江汉族人群核苷酸内焦磷酸酶磷酸二酯酶1（Ecto—nucleotidepyrophosphatase／phosphodies-terase1，ENPPl）基因第4外显子K121Q对糖尿病发病的影响及其两者之间的关系。方法运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）方法检测146例2型糖尿病（T2DM）患者（T2DM组）和238例糖耐量正常对照健康人（对照组）EN—PPl基因K121Q的多态性分布，同时检测其临床及生化指标，进行随机对照研究。结果①T2DM组XQ（KQ＋QQ）基因型频率高于对照组（21．23％VS10．50％，P=0．0038），其Q等位基因频率亦高于对照组（10．96％VS5．25％，P=0．0034），差异有统计学意义；②携带Q等位基因个体与携带K等位基因个体两组比较，在性别构成、年龄、身高、体重、体重指数（BMI）l、腰围、臀围、腰臀比（WHR）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素水平（FINS）、HOMA—IR差异均无统计学意义（P〉0．05）；（④Logistic回归显示，ENPPl基因K121Q多态性与T2DM相关（OR=2．30，95％CI=1．29—4．08，P=0．0038）；④汉族人群Q等位基因携带频率低于其他人群（非西班牙裔白人、美国黑人和西班牙人）。结论①ENPPl基因K121Q位点Q等位基因与中国黑龙江省汉族人群T2DM发病相关；②T2DM患者中携带Q等位基因个体无明显胰岛素抵抗表现；（~）ENPPl基因K121Q位点的多态性有明显种族地域差异性。

miR-196a2单核苷酸多态性与白血病发病风险的初步研究

背景与目的:mi R-196a2在肿瘤的发生、发展中起类似于原癌基因的生物学功能。其表达升高会促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,有望成为重要的肿瘤标志物。该研究旨在探讨mi R-196a2基因多态性位点rs11614913与白血病发病风险的关系。方法:采用病例-对照分析方法,收集2009年1月—2015年7月在烟台山医院检查确诊的210例白血病患者(病例组)及同期体格检查健康的250名正常体检者(对照组)的骨髓血或外周血,限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测mi R-196a2基因多态性位点rs11614913的基因型,应用χ2检验比较各基因型频率在病例组和对照组中的差异,采用Logistic回归分析计算SNP的等位基因的比值比(odds ratio,OR)和95%CI表示各基因型发生白血病的风险度。结果:病例组和对照组相比,mi R-196a2 rs11614913的T/T、C/C、C/T基因型频率的分布差异有统计学意义(P<0.05),携带突变型纯合子C/C基因型的个体患白血病风险是野生纯合子T/T基因型个体的2.661倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:mi R-196a2基因多态性位点rs11614913与白血病发病风险有关,突变型纯合子C/C或携带C等位基因可能是白血病发生的危险因素。

广州番禺区汉族人群2型糖尿病与Preproghrelin基因rs96217位点单核苷酸多态性的关系

目的探讨广州番禺区汉族人群2型糖尿病与Preproghrelin基因rs96217位点单核苷酸多态性的关系。方法提取番禺汉族人群中非糖尿病的正常人和2型糖尿病患者的DNA,采用PCR-RFLP,分析对照组和T2DM组Preproghrelin基因rs96217位点的基因型及组间基因型、等位基因频率分布的差异。结果对照组116例样本中,CC 96例、AC 20例,AA 0例;基因型频率分别为:82.8%、17.2%、0。T2DM组118例样本中,CC 89例、AC 24例、AA 5例,基因型频率分别为:75.4%、20.3%、4.3%。组间基因型和等位基因频率差异无统计学意义。结论广州番禺区汉族人群2型糖尿病与Preproghrelin基因rs96217位点单核苷酸多态性之间未见显著相关性。但T2DM组中发现AA基因型,而对照组未显,原因有待进一步研究。

血小板GPIa基因多态性与糖尿病视网膜病分型的关系

目的:探讨血小板糖蛋白Ia/IIa分子Ia链(GPIa)BglⅡ限制性片段长度多态性与2型糖尿病视网膜病(DR)分型的关系。方法:运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测180例2型糖尿病(DM)患者(DR+组62例,DR-组118例)及85例正常对照组的(CON)基因型。其中单纯型DR44例,增殖型DR18例。结果:(1)DR+组BglⅡ(+/+)基因型频率及BglⅡ(+)等位基因频率-明显高于DR-组及CON组(P<0.01),BglⅡ(+)等位基因与DR明显相关(OR=2.01,95%CI,1.29～3.12);(2)单纯型DR组与增殖型DR组BglⅡ基因型及等位基因频率分布差异无显著性(P>0.05)。结论:BglⅡ(+)等位基因可能是2型DM合并视网膜病变的危险因子,但与DR的分型无明显关联。

基因分型方法在结核分枝杆菌分型中的应用进展

结核分枝杆菌(Mtb)基因分型在结核病流行病学研究中应用广泛,对结核病疫情的监测、溯源和防控具有重要意义。Mtb基因分型方法中,IS6110限制性片段长度多态性分型曾经是国际公认的Mtb分型的“金标准”,但其缺陷明显,包括分型能力不足、对样本质量要求高和实验操作繁琐等;间隔区寡核苷酸分型技术操作简便且成本较低,稳定性较高,但其分型能力同样不足,结果可能趋向同型化;长序列多态性分型可以简便、快速鉴别牛型、人型和北京基因型菌株,并且在遗传进化研究中发挥重要作用;可变数目串联重复序列分型的分辨率高、可重复性好,可以根据不同情况优化位点组合,已经成为结核分子流行病学研究的重要方法;单核苷酸多态性分型具有高通量、高分辨率和结果准确性高等优点,在结核分子流行病学上的应用非常广泛,有望成为Mtb分型的下一个金标准。

胃癌组织中caspase 9的表达及其多态性变化

目的:探讨胃癌中caspase 9基因的表达及其单核苷酸多态位点的分布.方法:应用Western-blot方法检测70例胃癌患者及对应癌旁正常组织中caspase 9的表达情况.应用限制性片段长度多态性技术结合测序,分析70例胃患者及100例正常人caspase 9基因rs1052576位点基因型.应用列联表法统计分析患者组和对照组SNP位点基因型及等位基因频率.结果:51.4%(36/70)的胃癌组织caspase 9基因表达明显下调,与癌旁正常组织相比差异有统计学意义(P<0.05).位于caspase 9基因第5外显子的SNP位点rs1052576的基因型频率和等位基因频率在两组人群中的分布差异有统计学意义.患者组G等位基因频率明显高于对照组(22.9% vs 13.0%,P<0.05),AG基因型频率在有淋巴结转移的患者中明显高于无淋巴结转移的患者(P<0.05).结论:caspase 9基因在胃癌中低表达,rs1052576多态位点G等位基因和胃癌的发生相关,AG基因型和淋巴结转移有关.

肿瘤坏死因子基因多态性及与多发性硬化的相关性研究

目的对广东地区汉族MS患者作肿瘤坏死因子基因(tumornecrosisfactor,TNFβ)分型,探讨TNFβ基因与广东人群中MS遗传易感性的可能关系。方法采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性技术对30名无亲缘关系的MS的病人和103名无血缘关系的广东籍健康汉族人作TNFβ分型。结果TNFβ各等位基因型频率在MS组和正常人组间无显著差异(P均>0.5)。结论从目前调查的例数,广东人群中MS与TNFβ基因不关联。

改良PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T 位点多态性

目的建立一种简便、实用、准确的检测5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多态性的方法。方法在分析MTHFR基因C677T多态位点相关序列的基础上,设计1对特异性引物,通过聚合酶链反应扩增1个535bp的靶片段,该靶片段跨越MTHFR基因C677T多态位点,且在多态位点上游163bp处含有一个限制性核酸内切酶HinfI识别位点,该识别位点可作为后续HinfI酶切分型的内对照,PCR产物用HinfI快速消化,再用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物,得出相应的限制性酶切图谱用于判别基因型。结果可从限制性酶切图谱中明确判断各样品MTHFR基因C677T位点基因型,CC、CT、TT3种基因型样品的分型结果与基因测序完全吻合。采用本法检测了100例样品,检得MTHFRC677T3种基因型样品即CC、CT、TT的频率分别为0.59、0.35、0.06;C和T等位基因频率分别为0.765和0.235,符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.0723,P=0.965>0.05)。结论该方法由于PCR产物中含有HinfI酶切内对照序列,能克服传统PCR-RFLP法酶切不完全可能导致基因型误判的缺点,简便、实用、准确,适合一般实验室应用及流行病学调查。

结核分枝杆菌基因分型技术研究进展

结核分枝杆菌（Mvcobacterial tuberculosis，MTB）足结核病的病原体，可累及全身多种组织器官，以肺组织受累最常见。近几年由于流动人口的增加和HIV病毒感染的流行，结核病再次成为严亘危害世界公共卫生的传染病之一。结核病再度肆虐，其主要原因之一就是结核分支杆菌的变异。

中国汉族人群N-乙酰基转移酶1基因多态性的检测分析

目的 探讨N 乙酰基转移酶1(NAT1)基因型检测方法及其基因多态性的分布。方法 在140名汉族健康人的外周血中,应用聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性分析(RFLP)及多重PCR技术,进行NAT1等位基因分型研究。结果 应用PCR- RFLP+多重PCR方法避免了多种限制性内切酶之间相互干扰,可准确区分NAT1基因型。在140名检测标本中,NAT1* 3,NAT1* 4,NAT1* 10和NAT1* 11的发生频率分别是8 .2%、49. 6%、40%和2 2%。NAT1* 4发生率明显低于欧美人群,但高于东南亚人群;而NAT1* 10的发生率高于欧美人群,NAT1* 3和NAT1* 11的发生率较低,与大多数亚洲人群基本一致。结论 PCR RFLP+多重PCR方法检测NAT1基因型特异性高;NAT1基因型分布与其他国家检测情况有所差异。

碱基错配长PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点的多态性

目的:细胞周期蛋白H(CCNH)基因rs3093816位点的多态性与许多癌症的发生风险升高有关,但由于此位点缺少合适的限制性内切酶位点,使聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)的使用受到限制。因此,本研究拟建立碱基错配长PCR引物法用于检测CCNH基因rs3093816位点。方法:通过创造性酶切位点PCR-RFLP方法在CCNH扩增产物中引入新的酶切位点,然后利用Cvi Q I酶区分PCR产物。本研究同时设计了碱基错配长PCR引物和碱基错配相对短PCR引物,比较分析碱基错配长PCR引物是否更简便经济。结果:与短引物法相比,长引物占扩增总片段的比例越大,酶切产物越容易区分,凝胶电泳需要的时间越短。结论:成功建立了错配长PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点。

中国人群血管紧张素转换酶基因与血管紧张素Ⅱ-1型受体基因A^(1166)-C单核苷酸多态性分析

目的 研究血管紧张素转换酶 (ACE)基因Alu插入 (Ⅰ ) /缺失 (D)多态性与血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)基因A1166 C单核苷酸多态性 (SNP )在中国人群中的分布状态。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)及PCR 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法对中国人群ACE基因AluⅠ /D多态性和AT1R基因A1166 CSNP频率进行分析比较。结果 中国人群的ACE基因各基因型频率Ⅱ型37 0 % ,ID型 40 5 % ,DD型 2 2 5 % ;I,D各等位基因型频率分别为 5 7 3 % ,42 7%。AT1R基因A1166 CSNP频率分布 :AA型 76 5 % ,AC型 2 3 4% ,CC型 0 1% ;等位基因频率A 88 2 % ,C型 11 8%。结论中国人群ACE基因AluI/D与AT1R基因A1166 C的SNP频率的分布有明显的种族差异。

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列(variable number tandem repeats,VNTR)分析(multiple loci VNTR analysis,MLVA)中不同位点组合在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU)-12系列的HGI(Hunter-Gaston Index)值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型"金标准"IS6110-RFLP水平。

应用多重PCR-RFLP技术检测头发、口腔腭粘膜的ABO基因型

目的 探讨对头发、口腔腭粘膜等组织标本进行ABO基因分型的可行性。方法 应用多重聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (多重PCR RFLP)技术 ,检测 8例头发和 6例口腔腭粘膜标本的ABO基因型 ,标本的基因组DNA经 2对引物同时进行扩增 ,扩增后的产物同时用MspⅠ和KpnⅠ 2种限制酶进行消化 ,通过消化后产生的片段即可判断结果。然后将分析结果与血清学技术检测的ABO表现型和受检者血液标本的基因型进行比较。结果 14例标本共检出 6种ABO基因型 ,与表现型和血液标本的基因型结果完全一致。结论 该方法操作方便 ,重复性、稳定性好 ,可鉴定 15种基因型 ,应用于法医学鉴定具有可行性。

血浆同型半胱氨酸水平及N^5,N^(10)-亚甲四氢叶酸还原酶基因多态性与老年期抑郁症的关联研究

目的探讨血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与老年期抑郁症发病的关系。方法采用毛细管电泳-紫外检测法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术测定60例老年期抑郁症患者(抑郁症组)和80名正常人(对照组)的血浆总Hcy水平和MTHFR基因多态性。患者入组时评定汉密尔顿抑郁量表(HAMD),治疗第6周末评定疗效(HAMD减分率≥50%为有效,<50%为无效)。结果(1)抑郁症组的血浆Hcy水平[(17±6)μmol/L]明显高于对照组[(12±4)μmol/L],差异有统计学意义(P<0.01)。<60岁首次发病(以下简称首发)患者(n=30)的血浆Hcy水平[(16±5)μmol/L]与≥60岁首发患者[n=30,(19±6)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);单次发作患者(n=17)的血浆Hcy水平[(18±6)μmol/L]与反复发作患者[n=43,(17±5)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);伴心脑血管疾病患者(n=27)的血浆Hcy水平[(19±6)μmol/L]与不伴心脑血管疾病患者[n=33,(16±5)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05);治疗有效患者(n=40)的血浆Hcy水平[(18±5)μmol/L]与治疗无效患者[n=20,(17±6)μmol/L]的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)抑郁症组治疗前后HAMD评分的减分率与血浆Hcy水平无显著相关性(P>0.05)。(3)MTHFRC677T基因型有3种,即纯合子突变型(T/T)、杂合子突变型(T/C)和野生型(C/C)。抑郁症组的基因型及等位基因频率与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。抑郁症组患者的首发年龄、发病次数、是否伴发心脑血管疾病及抗抑郁药治疗第6周末的疗效与MTHFRC677T基因型分布均无关联(P>0.05)。(4)不同基因型的受试者(不论是抑郁症组还是对照组)血浆Hcy水平的差异无统计学意义(P>0.05)。结论血浆Hcy水平升高可能是老年期抑郁症发病的一个独立危险因素。