荧光MAPREC分析Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率方法的建立和应用

目的使用CY5荧光标记引物建立定量检测I型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MAPREC。方法提取I型Sabin株脊髓灰质炎病毒样品RNA,反转录合成c DNA后,进行非对称PCR扩增以生成单链DNA,之后采用CY5荧光标记引物进行一步扩增反应以合成双链产物,以DNA内切酶Dde I和Nci I酶切后电泳分离,获取荧光信号,计算样品的突变率。检测4个国际标准品(100%DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品和HMVR标准品)的突变率,重复5次,验证方法的准确性和精密度,并进行初步应用。结果使用CY5荧光标记引物,建立了定量检测I型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MAPREC。100%DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100.00%、2.00%、1.84%、2.56%,检测结果分别为95.09%、2.06%、1.45%、1.92%,各标准品的实验间CV值均<15%。I型Sabin株口服脊髓灰质炎减毒活疫苗工作种子、单次收获液和原液的突变率为1.05%~1.22%,批间一致性良好。结论初步建立了基于荧光素标记的MAPREC,可以代替同位素法进行I型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率的定量检测。