利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

基于聚合酶链式反应⁃限制性内切酶长度多态性方法鉴别鹿角(马鹿)药材及其配方颗粒

鹿角为鹿科马鹿Cervus elaphus或梅花鹿C.nippon已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基。目前市场上鹿角基原混杂,为快速准确地鉴别鹿角多基原及混伪品,研究通过比较马鹿、梅花鹿及其混伪品线粒体条形码Cytb基因序列差异,筛选获得鹿角的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计鹿角特异性鉴别引物dishmy⁃F及dishmy⁃R,分别采集鹿角及其混伪品,建立鹿角配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系,对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性和适用性考察,再使用限制性内切酶MseⅠ对梅花鹿与马鹿的扩增产物进行酶切。结果显示,当退火温度为56℃,循环次数为35时,鹿角药材、标准汤剂及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后,马鹿可在近100 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,且马鹿的条带较梅花鹿短约60 bp,而其他混伪品如驼鹿、驯鹿、白尾鹿、黑尾鹿、狍子、白唇鹿等及阴性对照均无条带。该研究建立的PCR⁃RFLP方法可快速准确的鉴别出鹿角药材、标准汤剂和配方颗粒中的马鹿成分,并可区分梅花鹿和其他混伪品,同时为其他中药配方颗粒质量标准研究提供了理论依据。

牦牛钙蛋白酶抑制蛋白基因部分片段PCR-RFLP多态性研究

钙蛋白酶抑制蛋白基因的产物参与肌肉生长过程中蛋白质的更新,在各肉畜中被认为显著影响肉的嫩度。本研究以牦牛钙蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)内含子6(intron 6)为研究对象,采用RsaⅠ、ScaⅠ、Eco O109I(DraⅡ)、XmnⅠ共4种限制性内切酶对其进行限制性酶切多态性研究,结果表明,牦牛CAST基因第六内含子长度为1460bp,与普通牛和绵羊CAST基因该片段的同源性分别为99%和91.6%。酶切分析表明,RsaⅠ、ScaⅠ均在第469位置有一个酶切位点,Eco O109I(DraⅡ)在第387和1156位有两个酶切位点,这三种酶酶切均未发现多态性,XmnⅠ在该片段没有酶切位点,该结果与研究者对普通牛的研究不同,普通牛在该片段有XmnⅠ酶切位点并且有多态性。

甲烯四氢叶酸还原酶基因多态性与2型糖尿病的关系

目的 :探讨中国人群 2型糖尿病患者中甲烯四氢叶酸还原酶 ( MTHFR)基因多态性与2型糖尿病发病的关系。方法 :采用 PCR技术和限制性内切酶片段长度多态性 ( RFLP)的方法检测患者的 MTHFR基因 677C→ T突变 ,统计各组对象的突变频率。结果 :MTHFR基因 677C→ T突变型等位基因 ( T)频率在病例组和对照组中差异无显著性 ( χ2 =2 .2 9,P>0 .0 5 ) ,TT、CT和CC3种基因型频率差异无显著性。基因型频率的相对风险分析 ,CT基因型患 2型糖尿病风险是CC基因型的 1 .96倍 ,TT基因型患 2型糖尿病风险是 CC基因型的 2 .5 7倍。结论 :MTHFR基因突变型等位基因与 2型糖尿病发生无必然的联系 ,突变基因型并没有增加

血管紧张素转换酶和血管紧张素原基因多态性及其与青海妊娠高血压疾病的相关性

目的探讨血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素原(AGT)基因表达、基因多态性与青海孕产妇妊娠高血压疾病的相关性。方法选择210例妊娠高血压患者(HDCP组)和220例正常孕妇(CK组),运用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测AGT M235T、ACE I/D基因多态性。结果CK组ACE基因DD、ID、Ⅱ所占比例分别为28.18%、47.73%、24.09%,HDCP组分别为33.81%、51.90%、14.29%(P<0.05,故两组的ACE基因分布有差异),HDCP组和对照组ACE I/D多态性等位基因I和D频率分布有差异(P<0.05),HDCP组D等位基因频率高于对照组(χ^2=5.188,P<0.05),ACE基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^2=0.423,df=2,查表χ^2界值表,P>0.05,达到遗传平衡);CK组AGT基因MM、MT、TT所占比例分别为24.09%、43.64%、32.27%,HDCP组分别为15.71%、42.86%、41.43%(P<0.05,故两组的AGT基因分布差异有统计学意义),HDCP组和对照组AGT M235T多态性等位基因M和T频率分布有差异性(P<0.05),HDCP组T等位基因频率高于对照组(χ^2=6.796,P<0.05),AGT基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^2=3.242,df=2,查表χ^2界值表,P>0.05,达到遗传平衡)。结论ACE I/D多态性和AGT M235T多态性与青海省汉族妊娠期高血压疾病有关,D等位基因和T等位基因可能是妊娠高血压疾病的易感基因。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与青海汉族妊娠期高血压疾病的相关性

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因-677C/T(rs1801133)多态性与青海汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDP)的相关性。方法选择青海省HDP患者139例(HDP组),正常妊娠孕妇145例(对照组),应用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法,检测HDP组和对照组MTHFR-677C/T多态性分型并测序验证。结果HDP组和对照组MTHFR基因CC、CT、TT基因型频率分别为54.68%、35.25%、10.07%和69.66%、22.06%、8.28%,CC基因型频率HDP组54.68%低于对照组69.66%(P<0.05),CT基因型频率HDP组35.25%高于对照组22.06%(P<0.05),而TT基因型频率HDP组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);HDP组和对照组MTHFR-677C/T多态性C和T等位基因频率分布有差异(P<0.05),HDP组T等位基因频率高于对照组(χ^(2)=5.568,P<0.05)。结论MTHFR基因-677C/T多态性与青海汉族HDP相关,MTHFR基因-677C/T多态性中T等位基因可能是HDP的易感基因,CT基因型为HDP的易感基因型。

青海省汉族妊娠期高血压疾病与维生素D受体基因FokⅠ多态性的关系

目的 探讨维生素D受体(VDR)基因单核苷酸多态性(SNP)FokⅠ(rs2228570/rs10735810)位点多态性与青海省汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDCP)的相关性。方法 选择青海省汉族HDCP患者137例(HDCP组),正常汉族孕妇146例(对照组),使用聚合酶链式反应-限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测HDCP组和对照组FokⅠ位点的基因分型并测序验证,使用SPSS 19.0统计学软件检验两组一般临床资料、基因型及等位基因频率分布差异是否具有统计学意义。结果 HDCP组和对照组FokⅠ位点FF、Ff、ff基因型频率分别为51.82%、37.96%、10.22%和34.93%、43.15%和21.92%(χ^(2)=11.099,P<0.05),HDCP组FF基因型(OR=2.004,95%CI=1.243~3.231)频率高于对照组;HDCP组和对照组FokⅠ位点F和f等位基因频率分布差异有统计学意义(χ^(2)=12.454,P<0.001),HDCP组F等位基因(OR=1.253,95%CI=1.105~1.421)频率高于对照组。结论 VDR基因FokⅠ位点多态性与青海省汉族HDCP相关,其中F等位基因可能是HDCP的易感基因,FF基因型可能是HDCP的易感基因型。

内皮型一氧化氮合酶基因G894T位点多态性与妊娠期高血压疾病患者脂代谢的相关性

目的 探讨内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因G894T位点多态性与妊娠期高血压疾病(HDCP)患者脂代谢的相关性。方法 选择邢台市第三医院2016年1月~2020年1月收治的528例HDCP患者为研究对象,并以同期128例正常妊娠者作为对照组。采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血,并检测血脂指标、胱抑素(CysC)及尿酸等生化指标水平。根据血脂水平分为血脂正常组和异常组,血脂异常组包括4个亚组[高三酰甘油(TG)血症组(TG≥1.70 mmol/L)、低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症组(HDL-C<1.04 mmol/L)、高总胆固醇(TC)血症组(TC≥5.18 mmol/L)、混合型高脂血症组(TG≥1.70 mmol/L、TC≥5.18 mmol/L)]。另采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度片段多态性(PCR-RFLP)方法对eNOS基因G894T位点进行基因分型分析,分为TT、GT、GG基因型。比较不同血脂水平者的基因多态性分布情况,并采用Logistic回归分析方法探讨血脂异常影响因素以及eNOS基因G894T位点多态性与血脂异常之间的关系。结果 研究组和对照组中GG、GT、TT eNOS基因G894T位点基因型的期望值和观测值均符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=0.651,P=0.722;χ^(2)=1.845,P=0.398),且研究组GG型基因频率和G等位基因频率高于对照组,TT型基因频率和T等位基因频率低于对照组(P<0.05);血脂异常组患者身体质量指数(BMI)、尿微量白蛋白与肌酐比值(UACR)、同型半胱氨酸(Hcy)、尿酸以及C-反应蛋白(CRP)水平相较于血脂正常组显著升高,但其降压药服用率更低(P<0.05)。血脂异常组eNOS基因(G894T)基因的GG基因频率和G等位基因高于血脂正常组,TT基因频率和T等位基因低于血脂正常组(P<0.001)。低HDL-C血症组、高TG血症组以及混合型高脂血症组患者的BMI均高于血脂正常组(P<0.05);混合型高脂血症组患者Hcy水平高于血脂正常组(P<0.05)。低HDL-C血症组和混合型高脂血症组的TT基因频率和T等位基因明显低于血脂正常组,GG基因频率和和G等位基因频率高于血脂正常组(P<0.05)。Logistic回归分析表明,基因型TT属于HDCP血脂水平异常的一种保护因素,基因型GG、高BMI、高Hcy水平属于血脂异常的独立危险因素。结论 妊娠期高血压疾病患者的eNOS基因G894T位点多态性与血脂异常之间相关性显著,其中基因型TT属于保护因素,基因型GG/GT属于独立危险因素;同时BMI、Hcy也会对血脂异常产生影响。

青海汉族妊娠期高血压疾病白细胞介素10基因启动子区-592A/C多态性分子特征

目的探讨白细胞介素10(IL-10)基因启动子区-592A/C(rs1800872)多态性与青海汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDP)的相关性,并确定该基因在HDP组和健康对照组中的表达情况。方法选择青海省HDP患者(HDP组)和正常妊娠妇女(对照组)各140例,以血液DNA为模板,应用限制性内切酶片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法检测HDP组和对照组IL-10-592A/C多态性分型并测序验证。应用Real-time PCR检测两组胎盘组织中IL-10 mRNA的表达。应用ELISA检测两组血浆IL-10水平。结果HDP组和对照组IL-10基因AA、AC、CC基因型频率分别为24.29%、44.29%、31.42%和13.57%、41.43%、45.00%,两组基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);AA基因型频率HDP组(24.29%)高于对照组(13.57%)(P<0.05),CC基因型频率HDP组(31.42%)低于对照组(45.00%)(P<0.05),而AC基因型频率两组间差异无统计学意义(P>0.05);IL-10-592A/C多态性A、C等位基因频率两组间分布有差异,HDP组A等位基因频率高于对照组(χ^(2)=8.079,P<0.05);HDP组胎盘组织中IL-10 mRNA表达量低于对照组(P<0.01);HDP组血浆IL-10水平(1.53±0.68)ng/L低于对照组(1.79±0.72)ng/L(P<0.01)。结论IL-10-592A/C多态性与青海汉族HDP相关;IL-10-592A/C多态性中A等位基因可能通过调节IL-10的表达参与HDP的遗传易感性。

聚合酶链式反应-限制性内切酶多态法检查川贝母的掺伪情况

目的应用DNA分子鉴定技术检测川贝母的掺伪情况。方法收集111份川贝母及其主要伪品对口药材,应用聚合酶链式反应-限制性内切酶多态法(PCR-RPLF)对川贝母、川贝母伪品及混合样品进行检测。结果该方法能够检出川贝母中伪品的掺伪量,随着掺伪量的增加,未切DNA条带灰度增强而被切条带减弱;未切条带相对于被切条带而言,其灰度比率相应增加;当掺伪量达75%时,几乎观察不到被切条带。结论所用方法灵敏度高,通过测量琼脂糖凝胶电泳图中DNA条带的灰度值强弱,可知道川贝母中大概的掺伪比例,可用于川贝母样品中掺伪量的检测。

浙江省汉族与畲族CYP2C19基因多态性研究

目的 调查浙江省汉族与畲族CYP2C19基因多态性。方法 采用PCR体外扩增CYP2C19的两个多态性位点CYP2C19*2(m1)和CYP2C19*3(m2),m1的PCR扩增产物用Sma I酶切,m2的PCR产物用BamH I酶切,琼脂糖电泳检测。结果 汉族与畲族各种基因型出现频率为:wt／wt:0.412,0.411;wt／ml:0.345,0.387;wt/m2:0.108,0.055;ml／ml:0.081,0.123;ml／m2:0.054,0.018;m2／m2:0.000,0.006。汉族与畲族CYP2C19不同等位基因出现频率:wt:0.639,0.632;ml:0.280,0.325;m2:0.081,0.043。结论 浙江省汉族m2出现频率高于畲族,且差异显著(P<0.05);畲族ml出现频率高于汉族。CYP2C19各种基因型:wt／wt出现频率汉、畲两民族相近;wt／m2,ml／m2基因型汉族大于畲族;wt／ml,ml／ml畲族明显高于汉族。

维吾尔族和汉族人群RANTES基因多态性特征及其对HIV-1感染的意义

目的 分析RANTES启动子区等位基因在中国维吾尔族和汉族健康人和HIV 1感染者中的分布特点 ,以期阐明RANTES基因突变型和人类免疫缺陷病毒(HIV 1 )感染在不同民族人群的关系。方法 利用PCR RFLP法对维吾尔族和汉族HIV 1感染者和健康人群的 86 5份样品的RANTES 4 0 3、 2 8等位基因进行检测。结果 两个位点在维吾尔族和汉族人群均有较高的等位基因频率 ,分布基本一致 ;RANTES等位基因具有 6个基因表型 ,分别为AC/AC、AC/AG、AC/GC、AG/GC、GC/GC和AG/AG ;从单倍型看 ,汉族和维吾尔族均以GC为最高 ,占 6 2 7% ,AC分别为 2 8 7%和 30 4 % ,AG分别为 8 6 %和 6 8%。但是从单个位点看 ,HIV感染者和健康人、吸毒者差异均无统计学意义(P >0 0 5 ) ;从基因表型分析 ,与AC/AC比较 ,AC/AG、AC/GC、AG/GC、GC/GC的OR值显示都有不同程度的关联(OR =0 33～0 81 )。结论 汉族和维吾尔族中RANTES启动子区 4 0 3/ 2 8均有较高的突变频率 ;与AC/AC比较 ,AC/AG、AC/GC、AG/GC。

原发性高血压患者的β-纤维蛋白原-455G/A基因多态性研究

目的 探讨 β-纤维蛋白原 - 4 5 5G/A基因多态性在山东地区汉族人群的分布以及该多态性与原发性高血压病的关系。方法 应用聚合酶链反应和限制性内切酶片段长度多态性技术 (PCR RFLP)检测了 14 8例健康人和 14 9例原发性高血压患者的 β Fg 4 5 5G/A基因多态性 ,比浊法测定血浆纤维蛋白原水平。 结果 β Fg 4 5 5G/A基因多态性分布在患病组和对照组均符合Hardy Weinberg平衡定律。在两组内A等位基因携带者血浆纤维蛋白原水平均显著高于GG基因型者。A等位基因频率在高血压组 (0 171)略高于正常对照组 (0 15 2 ) ,但差别无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论 β Fg 4 5 5G/A基因多态可能不是原发性高血压的遗传易感标志。

中国土族人群中细胞色素P450 2C19基因多态性的研究

为研究细胞色素P4 5 0 2C19在中国土族人群中的基因型 ,采用聚合酶链式反应与限制性内切核酸酶片段长度多态性技术分析了 10 0例无血缘关系土族人群的基因型。结果显示 4 6人为CYP2C19野生型纯合子 (wt/wt) ;4 5人为CYP2C19m1杂合子 (wt/m1) ;9人为CYP2C19m1突变型纯合子 (m1/m1)。与国内外相关报道比较 。

辽宁地区人群PPARγ 2基因Pro12Ala多态性与腹型肥胖的相关性研究

目的探讨过氧化物酶增殖体激活受体γ2基因(PPARγ 2)Pro12Ala多态性与腹型肥胖指数的关系。方法将研究对象健康对照者104人及2型糖尿病患者79人,按腰围/臀围比值(WHR)分为WHR正常组(121人)和WHR增高组(62人),应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测所有研究对象、2型糖尿病患者和健康对照人群中WHR正常组和WHR增高组PPARγ 2基因Pro12Ala多态性,并对其基因型进行对照分析。结果①全部研究对象WHR增高组和WHR正常组基因型频率和等位基因频率比较差异无显著性(P值分别为0.46及0.701)。②2型糖尿病组中WHR增高组和WHR正常组基因型频率和等位基因频率比较差异无显著性(P值分别为0.524及0.531)。健康对照组中WHR增高组和WHR正常组基因型频率比较差异无显著性(P=0.055),但等位基因频率比较差异有显著性(P=0.022)。结论 PPARγ 2基因的Pro12Ala多态性与辽宁地区无T2DM家族史的正常人WHR增高有关,而与T2DM组WHR增高不相关。

人白细胞L－myc遗传多态性分析

从人白细胞中分离ＤＮＡ，经ＥｃｏＲＩ酶切后，进行Ｌ－ｍｙｃＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交，得出人Ｌ－ｍｙｃ限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱。结果发现，经ＥｃｏＲＩ酶切产生Ｌ－带（１０ｋｂ）及Ｓ－带（６ｋｂ）。对Ｌ－ｍｙｃＲＦＬＰ与肺癌恶变与预后的关系进行了讨论。

脑梗死患者与其N^(5,10)亚甲基四氢叶酸还原酶基因关系的研究

目的:探讨脑梗死(CI)患者与其N5,10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的关系。方法:运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RELP)检测脑梗死患者MTHFR基因多态性。结果:MTHFR基因型有3种,即纯合子(C/C)型、杂合子(T/C)型、纯合子(T/T)型。3种基因型在病例组和对照组研究对象间的分布无显著性差异,但T等位基因在病例组和对照组研究对象间的差异有统计学意义。结论:MTHFR基因C677T突变与脑梗死的发生有关,MTHFR基因可能是脑梗死的易感基因之一。

中国荷斯坦奶牛与鲁西黄牛线粒体DNA多态性和系统进化分析

为阐明中国荷斯坦奶牛和鲁西黄牛的线粒体DNA多态性及其起源关系,提取了2个品种牛外周血液中的线粒体DNA(mtDNA),用PCR方法将牛mtDNA全长分为4段进行扩增,并用NlaⅢ、HpaⅡ、BglⅡ等16种限制性内切酶进行酶解消化,分析2个品种牛mtDNA的多态性,最终经7种限制性内切酶片段长度多态性分析,共归纳出4种主要的单倍型。通过对2个品种牛mtDNAD环全序列的聚类分析表明:鲁西黄牛和中国荷斯坦奶牛可能均为混合母系起源,源于欧洲普通牛和印度瘤牛。该研究结果对提高动物体外受精和体细胞核移植效率等生物技术平台有一定的理论指导意义。

ENPP1基因K121Q多态性与泰安地区人群2型糖尿病的相关性

目的探讨核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)基因K121Q多态性与泰安地区人群2型糖尿病的相关性。方法对居住在泰安的100例无血缘关系的2型糖尿病患者和150例健康对照者进行病例对照研究,运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析ENPP1基因K121Q多态性,观察Q、K等位基因和KK、KQ、QQ基因型在正常对照组和2型糖尿病组中的分布情况。结果糖尿病患者中KK基因型89例(89.00%),KQ基因型11例(11.00%),QQ基因型0例(0.00%),K、Q等位基因频率分别为94.50%和5.50%;正常对照组中KK基因型131例(87.33%),KQ基因型19例(12.67%),QQ基因型0例(0.00%),K、Q等位基因频率分别为93.67%和6.33%。在2型糖尿病患者和健康对照者之间,未发现基因型频率和等位基因频率的显著差别(P>0.05)。结论ENPP1基因K121Q多态性和泰安地区人群2型糖尿病没有显著相关性。