采用限制性酶切片段长度多态性和PCR指印技术对牛结核分枝杆菌分型研究

5株牛结核分枝杆菌DNA经PvuⅡ消化后 ,用来自IS10 81中的 2 48bp荧光探针杂交后进行限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)分型 ,5株牛分离株中有 4株具有相同杂交带型 ,剩余的 1株在 3.6kb处多了 1条带。将 2 48bp探针对北京牛结核分枝杆菌分离株的RFLP分型法结果与直接反向PCR分型法对上述分离株分型结果比较发现 :5株牛结核分枝杆菌分离株中有 2株具有相同的PCR指印带型 ,剩余 3株牛结核分枝杆菌分离株则PCR指印带型各不相同 ,上述结果显示出 ,直接反向PCR分型法较标准的RFLP分型法分型能力强。直接PCR法对新疆牛结核分枝杆菌分离株的分型结果显示出 ,PCR指印带型中带数较少 ,且与北京牛结核分枝杆菌分离株的PCR指印带型截然不同。

应用限制性酶切片段长度多态性及变性高效液相色谱法筛选胶质瘤易感基因ERCC2的单核苷酸多态性比较

目的利用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)及变性高效液相色谱法(DHPLC)筛选和鉴定脑胶质瘤易感基因———切除修复鼠缺陷交叉互补基因2 (ERCC2)的单核苷酸多态性(SNPs)。方法应用PCR扩增179例胶质瘤病人肿瘤及血液标本和44例正常对照组血液标本ERCC2基因第23外显子及其邻近的部分内含子序列,采用限制性酶切及DHPLC技术对扩增片段进行基因变异检测,直接测序不同类型的PCR片段,并与参考序列进行对比分析。结果在此片段中验证了一个已知白种人存在的SNP位点。结论黄种人亦存在rs13181,并影响蛋白编码;可能与胶质瘤的发病有关联。DHPLC相对于RFLP来说是一种高效、经济、简便、可靠的SNPs筛选方法。

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析 (RFLP)鉴别乙型流行性感冒 (流感 )病毒的巴拿马株与维多利亚株 ,对乙型流感病毒血凝素 (HA)基因采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增后 ,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示 :乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增 ,且与甲1与甲3 型流感病毒无交叉反应。该片段经HindⅢ酶切后 ,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现 6 0 3bp与 2 4 2bp的 2个片段 ,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无 HindⅢ酶切位点 ,仍呈 872bp的一个片段。表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充 ,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定 。

儿茶酚O-甲基转移酶基因多态性分析方法探讨

目的建立限制性片段长度多态性(RFLP)和变性高效液相色谱(DHPLC)分析儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因多态性的方法,探讨分析基因多态性与临床疾病发生风险关系的方法学。方法从子宫内膜癌患者和对照组的全血和蜡块包埋组织提取DNA,应用RFLP和DHPLC法检测COMT基因第4号外显子第158位密码子G/A的多态性,并结合DNA测序法分析两种方法的一致性。结果全血和蜡块组织提取的DNA均可扩增PCR产物,且可行酶切反应;所有全血和小部分蜡块DNA PCR产物可行DHPLC分析。测序法与RFLP法比较,Kappa值=0.697;与DHPLC测序法比较,Kappa值=0.924。结论 RFLP与测序法的一致性好,适用于全血和蜡块提取的DNA的基因多态性分析;DHPLC与测序法的一致性极好,但对机器和样本要求较高,适用于血DNA的基因多态性分析。

几种杀虫药剂敏感蚊类酯酶多态性的研究

通过蚊虫酯酶蛋白的淀粉凝胶电泳分析和基因组DNA的限制性酶切片段长度多态性(RFLPs)比较 ,对尖音库蚊Culex pipiens、三带喙库蚊 Culextritaeniorhynchus 和中华按蚊Anophelessinensis有机磷杀虫药剂敏感种群的酯酶蛋白和结构基因的多态性进行分析。发现在蛋白质水平上 ,三带喙库蚊敏感种群 (n =5 4)在酯酶α和 β位点分别存在 2个和 3个等位基因 ,在DNA水平上有 2 9%的个体具有与酯酶 β11基因 1 3kbcDNA片段同源的 1 3kb单拷贝带存在。发现中华按蚊敏感种群 (n =5 0 )中具有低活性的非特异性酯酶存在 ,在蛋白质水平上 ,酯酶α和β位点各有一个等位基因 ;在DNA水平上 ,通过对单个蚊虫基因组DNA的研究未发现有与酯酶β11基因同源的酯酶编码基因的存在。对尖音库蚊北京敏感种群 (n =6 4)的研究发现 ,在酯酶α和 β位点都存在 5个等位基因 ,在DNA水平上 ,使用一个限制性内切酶 (EcoRI) ,15只蚊虫的样本在酯酶β位点发现了 5个等位基因 ,说明在尖音库蚊北京敏感种群的酯酶 β基因周围存在着较大的中性多态性 ,在有机磷杀虫剂的选择下 。

非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用

由于有相当数量的土壤微生物是目前不可培养的 ,因此利用传统培养技术来研究土壤微生物 ,不仅费时费力 ,所得到的结果可能和真实的情况相差甚远。近年来发展了三类不需培养的方法来研究土壤微生物的种类和数量 ,这些方法大体上分为生物化学、生理学和分子生物学三类。生物化学方法主要根据细胞膜磷脂酸 (PLFA)的种类和数量来判定微生物的多样性 ;BIOLOG微量板分析系统是生理学方法的代表 ,它主要是根据土样细胞悬液对 95种单一碳源的利用模式来说明群落结构的变化 ;分子生物学方法是发展应用最广的方法 ,基本步骤是提取土壤的总DNA ,然后用通用引物或选择性高的引物来扩增 16SrRNA基因。由于对扩增产物分析方法的不同 ,该方法又可分为PCR DGGE ,PCR RFLP等。最近在PCR RFLP基础上发展起来的T RFLP分析方法 ,将微生物的多样性分析工作同RDP(ribosomaldatabaseproject)数据库结合 ,充分利用了Internet的数据资源共享的优势 ,具有分辨率高 ,可实现自动化等优点 ,是未来土壤微生物生态学研究的有力工具。

广西巴马地区长寿老人 ApoE 基因多态性与认知功能的关系

目的:研究广西巴马地区长寿老人载脂蛋白E(ApoE)基因多态性的分布及其与认知功能改变的关系。方法:采用简易精神状态量表(MMSE)对112例90岁以上广西巴马地区长寿老人进行认知功能检查,并用限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法进行ApoE 基因分型。根据MMSE 得分将研究对象分为认知功能正常组和认知功能障碍组.比较两组人群的基因型、基因频率的分布特征。结果:巴马长寿老人中发生认知功能障碍者占14.29%。长寿老人中ApoEε3/3基因型分布的百分比最大,其次是ε2/3,而ε4/4最少。ApoE 各基因型和等位基因频率认知功能正常组和认知功能障碍组相比较,ε4等位基因频率认知障碍组明显高于认知正常组(P<0.01),ε4基因携带者认知功能障碍发生率明显高于其他基因携带者。结论:巴马地区长寿人群中,ApoEε3/ 3为最常见的基因型,而ε4/4最少;ApoE 基因多态性与巴马长寿老人认知功能改变有关联;ApoEε4基因仍然是长寿老人认知功能障碍发病的危险因子,较低的ApoEε4等位基因频率可能是巴马地区长寿老人认知功能保存较好的原因之一。

氨胁迫对猪粪厌氧消化性能的影响

以猪粪为原料,采用批式试验方法,研究不同氨氮添加量(0、400、800、1600、2400、3200、4000 mg·L-1)对厌氧消化产气效果的影响。结果表明:随着氨氮添加量的增加,总产气量和CH4产率均呈现先升高后降低的变化趋势,氨氮添加量≥2400 mg·L-1时,厌氧消化过程受到显著抑制;不同处理中猪粪挥发性固体(VS)的CH4产率分别为328.5、338.1、323.2、304.9、276.2、124.9、56.1 m L·g-1。氨氮添加量为0~800 mg·L-1时,最大VS产CH4速率分别为18.3、18.4、17.1 m L·g-1·d-1;氨氮添加量为2400 mg·L-1时,产气高峰推迟,产CH4速率明显降低;氨氮添加量≥400 mg·L-1时,厌氧消化30 d底物的生物转化产CH4效率随氨氮添加量的增加逐渐降低,分别为56.7%、54.5%、52.4%、30.6%、1.6%和1.3%;氨氮添加量为400~2400 mg·L-1时,乙酸利用型产甲烷菌Methanosaeta的相对丰度总体随氨氮质量浓度的增加而降低,而氢利用型产甲烷菌Methanosarcina和Methanococcus具有相反的变化规律。

Bcl-2基因多态性与乳腺癌临床生物学指标的关系

目的：探讨凋亡基因Bcl-2启动子区C（-938）A单核苷酸多态性（snigle nucleotide polymorphism,SNP）与河北省乳腺癌患者临床生物学指标的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法检测113例乳腺癌患者Bcl-2基因C（-938）A SNP的3个基因型（即AA、AC和CC）,并与临床生物学指标相关联,比较各组间基因型频率的分布情况。结果：按腋淋巴结转移个数进行分层分析,AA型和AC＋CC型在无转移、1~3个转移、≥4个转移组中分别占26.8%、47.8%、52.6%和73.2%、52.2%、47.4%,两组比较差异有统计学意义（χ2=6.337,P=0.042）;与AC＋CC型相比,AA型在≥4个转移组OR值为3.041（95%CI：1.072~8.626）。在组织学分级中,AA型和AC＋CC型在Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级中分别占30.9%、57.9%和69.1%、42.1%,两组基因型分布差异有统计学意义（χ2=5.055,P=0.025）;与AC＋CC型相比,AA型在肿瘤分化Ⅲ级组中OR值为3.082（95%CI：1.122~8.465）。按雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和C-erbB2蛋白表达水平进行分层分析,发现AA型和AC＋CC型的上述指标分布差异无统计学意义（χ2=3.005,χ2=1.504,χ2=1.163;P〉0.05）。结论：乳腺癌患者Bcl-2基因C（-938）A SNP的AA基因型与其腋淋巴结转移率较高和肿瘤组织分化较差相关。

弓形虫基因型鉴定方法的研究进展

弓形虫是一种重要的人兽共患原虫。已知弓形虫仅有一个种,但存在众多的基因型。研究表明,弓形虫基因型分布具有明显的地域性。对分离的弓形虫虫株进行基因型鉴定,对其分子流行病学、感染的溯源以及弓形虫病的预防和控制具有重要意义。本文对弓形虫基因型的鉴定方法进行了总结,为更好地选择合适的分型方法等提供参考。

16S rRNA基因RFLP用于不同科细菌区分

[目的]了解16SrRNA基因在细菌区分中的应用价值。[方法]细菌热裂解后用荧光(FAM,JOE)标记引物进行扩增,产物用HaeIII消化并进行毛细管电泳。[结果]所有细菌PCR产物均产生255bp片段,酶切产物电泳后具有科间差别。[结论]该方法可以用于不同细菌之间的分科。

PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23 S rRNA基因作为鉴别靶基因,采用通用引物PCR(UP-PCR)进行扩增,并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP)。结果针对23S rRNA基因片段的Hpa II酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示,14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大,有利于进行细菌鉴定。结论运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。

河南IBV肾变型地方分离株的分型研究

在气管环上进行交叉中和试验,结果显示河南分离的肾变型宜毒株与除T株以外的其余标准血清型毒株(M41、Holte、Arka、Conn、Gray)均有不同程度的交叉,但与Ark株相关性最大,为25%。将除Holte株以外的5株标准株和宜株的0.6kb扩增产物,用三种限制性内切酶AluⅠ、TaqⅠ和AfaⅠ进行酶切,RFLP分析可分为三种模式,宜株与Ark株、Gray株、CoNn株属同一模式,AluⅠ和AfaⅠ酶切阳性而TaqⅠ酶切阴性。另AluⅠ、TaqⅠ、AfaⅠ酶切均阳性的M41模式和TaqⅠ、AfaⅠ酶切阳性而AluⅠ酶切阴性的T株模式。将地方株宜株的0.6kb扩增片段进行测序并与标准株Ark株、Gray株、Conn株、Holte株和M41株的相应序列进行分析比较,核苷酸、氨基酸同源性的分析显示,宜毒株与同一酶切类型的Ark＿1529＿29株同源性最高,核苷酸同源性为93%,氨基酸同源性为91.6%。推测宜株可能是Ark血清型毒株的变异株。宜株与Ark株在血清学分型与基因分型上的一致性,表明这两种分型方法之间有一定的内在联系。

16S-23S rRNA间区基因RFLP用于病原菌区分

[目的]探讨16S-23SrRNA间区基因RFLP用于临床常见病原菌区分的可能性。[方法]183株临床分离来的细菌经荧光PCR扩增后进行不完全限制性酶切,产物进行毛细管电泳。[结果]所有细菌的酶切产物经毛细管电泳后,不同细菌产生不同的RFLP谱图,互相之间能够明显区分。[结论]该方法可以将临床常见病原菌准确区分到种的程度,极有应用价值。

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。

SUR1基因多态性与2型糖尿病的相关性研究

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)与磺脲类药物受体1(SUR1)基因多态性的关系。方法:随机提取正常人136例(正常组)及2型DM患者173例(T2DM组)外周血白细胞基因组DNA,PCR扩增SUR1基因24号内含子多态性位点的区域,用限制性酶切片段长度多态性分析其基因型,并用测序证实不同酶切图形基因型的准确性。结果:T2DM组和正常组SUR1基因第24号内含子基因型及等位基因分布差别有统计学意义(P<0.05)。结论:SUR1基因可能是中国天津地区2型糖尿病发生的易感基因。

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。

河南省汉族人群肿瘤坏死因子α基因启动子区单核苷酸多态性

目的研究河南省汉族人群无关个体217例肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因启动子区的-238G/A、-308G/A、-850C/T、-863C/A共4个单核苷酸多态性(SNPs)位点的遗传多态性。方法采用限制性酶切片段长度多态性(RFLP),结合质量分数6%聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法对SNPs位点进行分型。结果选择的TNF基因上4个SNPs位点等位基因和基因型频率分布在河南省汉族人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,各等位基因频率均大于5%,等位基因最小频率分布在5.8%～14.1%。4个SNPs位点共观察到21种组合基因型,杂合度为0.461。根据SHEsis软件推测出11种单体型,单体型多样性为0.608。结论河南省汉族人群TNF基因4个SNPs位点及其组成的单体型具有较高的多态性,在法医学实践中有一定的应用价值,同时为人类遗传学的研究提供基础资料。

血小板内皮细胞粘附分子基因G+1688A多态性与中国汉族老年心肌梗死患者的相关性研究

目的探讨血小板内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)基因G+1688A(Ser563Asn)多态性与老年人群心肌梗死(myocardial infarction,MI)的关系。方法采用病例-对照研究,应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对100例老年MI患者和120例老年非冠心病对照人群PECAM-1基因的第8号外显子区单碱基突变多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行分析,即基因型和等位基因频率在两组中的分布规律及其与MI的关系。结果AA基因型频率在病例组与对照组之间有显著差异(43%:24%,p<0.001),等位基因间亦存在同样的趋势(A/G:65%:54%,p<0.001)。而且在高胆固醇或收缩压过高的人群中,基因型为AA者患MI的危险度增高。结论在老年MI患者中,PECAM-1基因G+1688A点突变多态性与MI发病密切相关,可能是老年患者MI的遗传危险因素。