呼吸缺陷型啤酒酵母菌株的重离子束辐照诱变筛选及其线粒体的限制性酶切分析

利用单核能为5.19MeV/u的22Ne5+辐照啤酒酵母菌株,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchloride,TTC)筛选培养基快速筛选呼吸缺陷型酵母菌株。通过一种新型而简便的限制性酶切分析手段,发现辐照后的呼吸缺陷型酵母菌株线粒体DNA发生明显变化,主要表现在与对照相比线粒体DNA出现大片段缺失,同时出现了少量新的条带,并在此基础上初步探讨离子束辐照诱变产生呼吸缺陷型酵母菌株的诱变机理。

产蛋下降综合征病毒DNA限制性酶切分析的研究

选用BamHI、KpnI、PstI、EcoRI、XbaI、HindⅢ等6种限制性内切酶对EDS76病毒内蒙古地区分离株穴N3、B4雪和参考株穴AV-127雪病毒基因组DNA进行酶切分析,均产生4,5,9,4,2和10条DNA片段,而且N3、B4株与参考株病毒基因组DNA之间的酶切图形、片段大小也十分相似,从分子水平上证实N3、B4株是EDS76病毒熏同时也说明限制性内切酶分析法是检测EDS76病毒的一种简便快速的方法。

致病性钩端螺旋体限制性内切酶酶切分析分型研究

为了建立一种简便、稳定的钩体分型方法，我们采用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ对致病性钩端螺旋体八个血清群５４个血清型６４株国内外钩体参考株及２７株野生株进行限制性内切酶酶切分析（ＲＥＡ）。结果表明：９１株菌中共有５９种不同的限制性内切酶图谱（ＲＥＰｓ），根据前５条高分子酶切片段可以区分不同的ＲＥＰｓ；除部分血清群中个别不同的血清型有相同的ＲＥＰ型外，大部份血清型都有其独特的ＲＥＰ型，同一血清群往往拥有共同的酶切片段；所研究的同一血清型的国内和国际参考株的ＲＥＰｓ不同；大多数野生株的ＲＥＡ型和参考株相同，差异仅表现为个别高分子带的缺少和增加，ＲＥＡ分型和血清分型吻合较好，通过ＲＥＡ分型基本可区分不同的血清型。

柳毒蛾核型多角体病毒内蒙株(LsNPV-IM)DNA的限制性内切酶谱分析

将柳毒蛾核型多角体悬液降解 ,降解产物经 Tris-饱和酚和氯仿抽提 ,乙醇沉淀分离出Ls NPV-DNA.用限制性内切酶 Pst ,Hind ,Pst /Hind ,Hind /Eco R 和 Pst /Bam H 单酶切或双酶切 .经琼脂糖凝胶电泳并对其结果进行分析 。

RT-nestedPCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型

为建立检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中汉坦病毒 (HV)基因的RT nestedPCR方法 ,并进一步进行限制性酶切分型 ,设计并合成互补于HVS基因片段的引物 ,对 78例HFRS患者血清进行RT nestedPCR检测 ,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示 ,阳性率分别为 76 % (≤ 7天 )、6 7% (8～ 14天 )、43% (15～2 1天 )和 2 9% (>2 1天 )。 48例检测阳性患者PCR产物酶切分型 ,47例为Ⅰ型 ,1例为Ⅱ型。提示RT nestedPCR用于早期HFRS患者的HV基因检测 ,具有直接、敏感、特异等优点 。

采用PCR法和限制性内切酶分析对12种分枝杆菌进行鉴定

采用６５ＫＤａ热激蛋白基因为模板，选择位于３９８－８３６基因序列处的一对分枝杆菌通用引物，扩增出４３９ｂｐ的基因片段。将１２种标准分枝杆菌的ＰＣＲ扩增产物即４３９ｂｐ用ＢｓｔＥⅡ限制性内切酶作酶切分析，根据酶切带型的大小、强弱以及带型数量进行分枝杆菌菌种鉴定。通过对１２种分枝杆菌的ＰＣＲ反应和限制性酶切分析，可将被检标本中大部分的分枝杆菌鉴定到种。本试验无需进行杂交或使用放射性物质，２４ｈ即可完成。

新疆地区皮肤利什曼病病原体SSU rDNA PCR扩增及限制性酶切分析

我们采用引物R200和R300，对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（CL）患者的皮肤病变组织内抽提的微量利什曼原虫SSUrDNA，以及有关利什县原虫种株的SSUrDNA进行PCR扩增，然后分别采用限制住内切酶Rsal和Hhal对PCR扩增产物进行限制性酶切分析。结果显示：采用RsaⅠ进行限制性酶切分析，克拉玛依地区2例CL患者皮肤病变组织标本的PCR扩增产物经酶切后，其电泳图形与L．tropica完全相同。显示克拉玛依地区CL病原体SSUrDNA的PCR扩增产物与L．tropica存在相同的限制性内切酶图谱。

绿头鸭mtDNA限制性内切酶酶切分析

采用碱变性法制备绿头鸭肝细胞ｍｔＤＮＡ，经纯化后测其分子量为１６．７ｋｂ．用限制性内切酶进行酶切分析，结果表明ＢａｍＨⅠ、ｐｓｔⅠ和ＨｉｎｄⅢ在绿卖鸭ｎｔＤＮＡ分子上分别有４个、２个和３个酶切位点。与由番鸭、北京鸭和建昌鸭肝细胞ｍｔＤＮＡ为材料所得的研究结果比较，发现绿头鸭与番鸭及家鸭在ｍｔＤＮＡ种质方面存在着高度差异。

马立克氏病病毒Rispens株和RL株B抗原基因的分离、克隆及初步酶切分析

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）血清Ⅰ型Ｒｉｓｐｅｎｓ株和ＲＬ株分别接种于原代鸡胚成纤维细胞，待出现８０％以上细胞病变后收获，经蛋白酶Ｋ消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀细胞和病毒的总ＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡ）。以此为模板，根据已发表的Ｂ抗原基因核苷酸序列设计１对引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增出１条约２．８５ｋｂ的特异性条带，斑点杂交证实其为Ｂ抗原基因。双酶切消化后，克隆到质粒ｐＵＣ１９中。酶切分析表明，在这２株病毒的Ｂ抗原基因上，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ的酶切位点分布与超强毒ＲＢＩＢ株、标准强毒ＧＡ株的完全相同。

双孢蘑菇mtDNA粗提物的酶切分析

发展了一种粗提双孢蘑菇mtDNA的方法 ,获得As2 796亲代及子代系列菌株的mtDNA粗提物 ,用HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI等内切酶进行酶切 。

鹑源减蛋综合征病毒QAVc-94株的酶切图谱分析

选HindⅢ、EcoRⅠ、PstⅠ、SphⅠ、BamHⅠ和BglⅠ 6种限制酶 ,对QAVc_94株和AV_12 7国际标准株的DNA进行酶切图谱比较结果发现 ,QAVc_94株用上述 6种酶酶切得到的片段数分别为 10、3、12、4、6、9条 ,将各片段碱基数相加得出其基因组长 34 7kb ,略高于国内的报道 ,而与Zask等的结果相接近 ,从分子水平上将QAVc_94鉴定为一株EDSV。对照AV_12 7株的酶切结果与文献报道相符。QAVc_94株酶切图谱分析显示 :HindⅢ和EcoRⅠ的酶谱与报道的其他EDSV分离株基本相似 ,HindⅢ的酶谱与国内研究最多的AA_2长春分离株一致 ,EcoRⅠ的酶谱结果与Zask等报道的B8/ 78株相同。而其他 4种限制酶的酶切图谱与已报道的各地分离株相比 ,差异较大 ,如PstⅠ和BglⅠ多出 2～ 5个识别位点。说明鹌鹑源EDSV已与鸡源、鸭源、鹅源EDSV有较大的变异 ,是一株血清型相同而基因型不同的鹌鹑减蛋综合征病毒。

念珠菌DNA的提取及DNA酶切多态性分析的研究进展

念珠菌是院内感染的重要菌之一。

贵州省江口县土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变分析

目的:了解贵州省江口县土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症的基因频率、基因突变类型特点及分布特征,从分子水平揭示G6PD基因多态性。方法:采集世居当地土家族男性血液样本227例,用四氮唑蓝(NBT)纸片定性法及G6PD/6PGD比值法做G6PD缺陷症筛查。确诊者用错配引物介导的聚合酶链反应/限制性内切酶酶切分析法(PCR-RE)进行中国人常见9种G6PD基因突变型分析,突变特异性扩增系统法(ARMS)验证其中3种突变。结果:227名土家族男性中检出17例G6PD缺陷者,总检出率7.49%,G6PD缺陷症基因频率0.0749。基因分析检出cDNA 1388(G→A)12例,在G6PD缺陷者中的基因频率为0.706,未知突变5例,基因频率为0.294。结论:G6PD缺陷症在贵州土家族人群有着较高的基因频率,其主要突变类型为G6PD基因cDNA 1388(G→A)。

28S rDNA PCR-RFLP分析在侧耳属系统发育研究中的应用

对侧耳属 18个种 5 2个菌株及 3个其它属的菌株的 2 8SrDNA 5’端进行PCR扩增 ,得到长度约为 1.4 6kb的片段。对该片段分别用 7种限制性内切酶AluⅠ、BamHⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ、MspⅠ、TaqⅠ酶切 ,结果表明 ,MspⅠ酶切片段多态性最高 ,AluⅠ对侧耳属无酶切多态性。聚类分析结果表明 ,菌株间的相似系数为 0 .5 6 9～ 1.0 0 0 ,在 92 %相似水平可将侧耳分为 5大类 :Ⅰ .红平菇和桃红侧耳 ;Ⅱ .鲍鱼菇和囊盖侧耳 ;Ⅲ .具核侧耳 ;Ⅳ .金顶侧耳 ;Ⅴ .

限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒检测及分型中的应用

目的 探讨限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒B1～B6型检测及分型中的应用。方法 利用GCG软件对柯萨奇B1～B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析。结果 共 114种限制性内切酶在柯萨奇B1～B6型病毒cDNA中分布有不同数量的酶切位点。经过比较和分析 ,得到了它们的一个共同cDNA片段 ,在这个cDNA片段中 ,B1～B6型病毒各自具有特异性的核苷酸序列 (特异的限制性内切酶位点 ) ,对柯萨奇B组病毒 6个已知型别标准毒株进行了成功的分型和检测。结论 本方法有效地解决了在柯萨奇B组病毒检定以往方法中所存在的非特异性问题 ,可以对柯萨奇B组病毒进行准确的检定和型别鉴定。

应用反转录聚合酶链式反应检测鸡Th1样淋巴因子mRNA表达的研究

应用反转录聚合酶链式反应(RT_PCR) 和限制性酶切分析技术对鸡脾细胞体外受到有丝分裂原ConA刺激的情况下,其Th1 样淋巴因子mRNA的表达水平进行了研究。实验结果表明,ConA诱导培养3 小时的鸡脾细胞表达α_干扰素(ChIFN_α) 、γ_干扰素(ChIFN_γ)和白细胞介素_2(ChIL_2) 等鸡的Th1 样淋巴因子mRNA。未诱导但培养了3 小时的鸡脾细胞可表达ChIFN_α和ChIFN_γmRNA,而未检测到ChIL_2m RNA的表达。正常SPF鸡的脾细胞可表达ChIFN_αmRNA。本研究应用不同公司生产的反转录酶和Taq 多聚酶,取得了相同的结果。表明该方法具有很好的重复性,而且该法敏感而方便。

草菇栽培菌株DNA多态性的PCR-RFLP和RAPD分析

12个草菇栽培菌株的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(mtDNA)和基因组总DNA的多态性被研究了。应用PCR-RFLP技术,扩增了rDNA5.8s+ITS区段及mtDNA小区段,并进行限制性酶切分析,结果表明菌株间的rDNA在5.8s+ITS区段的遗传差异小,据此只能将测试的12个菌株分为两类;而对mtDNA小区段的检测未能显示出菌株间的差异,表明测试的菌株在所研究的区段具有很高的遗传相似性。在此基础上,对基因组总DNA的RAPD分析表明,菌株两两间的遗传相似系数在0.554到0.898之间,而平均相似系数为0.707。通过平均链锁聚类方式(UPGMA)聚类,发现在相似系数0.710水平上,供试菌株可分为四大类。这些研究结果为草菇的育种提供了科学依据。

广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究

目的研究广西崇左市葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因突变类型。方法对广西崇左市510例病例采用四氮唑蓝定量法筛查G6PD活性。对诊断为G6PD缺乏的病例采用PCR/限制性内切酶消化试验检测出G1376T、G1388A、A95G、G871A和C1024T 5种常见G6PD基因突变类型,用DNA直接测序法检测未确定突变类型的标本。结果在广西崇左市510名居民中筛查出52例G6PD缺乏症,其缺乏率为10.20%。在52例G6PD缺乏症标本中,检出G1376T突变14例、G1388A突变12例、A95G突变13例、G871A突变6例、C1024T突变1例,C1360T突变1例、C519T突变1例,未定型4例。结论 G6PD缺乏症在广西崇左市的发病率为10.20%。G1388A、G1376T、A95G也是广西崇左市G6PD缺乏症最常见的基因突变。发现G6PDUnion 1例,很可能属于零星分布。

吉林省非综合征型耳聋分子病因学分析——线粒体DNA12SrRNA1555位点突变基因筛查

目的探讨吉林省耳聋人群的病因学特征,考察本地区非综合征型耳聋线粒体基因(mtDNA)12SrRNAA1555G突变频率。方法收集长春市聋哑学校129例NSHI学生外周静脉血,提取mtDNA,PCR扩增目的基因片段,限制性内切酶(Alw26I)酶切分析,检测mtDNA A555G突变。结果被检测的129例NSHI学生(AmAn耳毒性致聋者37例),mtDNA A1555G突变阳性者3例,其中2例为初步确定为AmAn耳毒性致聋者,推测本地区NSHI耳聋mtDNAA1555G的突变频率为2.33%,由AmAn耳毒性致NSHI人群中mtDNA A1555G的突变频率为5.41%。结论AmAn耳毒性致聋是吉林省非综合征型耳聋的重要致病原因。通过对特定人群进行mtDNA A1555G突变基因的筛查,并对阳性个体进行早期干预,可降低药物性耳聋的发病率。

不同地区牛瑟氏泰勒虫主要抗原32k蛋白编码基因酶谱分型

提取日本和澳大利亚等不同地区牛红细胞感染瑟氏泰勒虫的ＤＮＡ，利用其主要表面抗原３２ｋ蛋白编码基因的５’和３’端附近序列合成一对引物，经ＰＣＲ方法扩增出约９００ｂｐ大小的基因片段，连接入ｐＢＲ３２２质粒中，转出入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经四环素及氨苄青霉素培养筛选出２０～３０个克隆，再用ＰＣＲ方法扩增出每个克隆的靶基因，经ＨｉｎｄⅢ，ＢｇＩＩ和ＫｐｎⅡ限制性内切酶消化后电泳，可分出１型、２型和３型不同酶谱电泳型，且证明不同地区牛感染此原虫的类型不同。