限制性酶切图谱法检测Wilson病突变热点

Wilson病(WD)是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传性疾病，为较常见的神经遗传病。致病基因定位于13q14．3，共有21个外显子。近年来国内外学者对WD基因进行分析，认为WD结构基因发生突变，可导致编码的ATP7B蛋白质结构异常，铜转运功能降低或丧失而致病；同时发现基因突变特点存在种族差异，欧裔患者14号外显子的His1069Gln和18号外显子的Gly1266Lys两种突变频率较高。

幼儿园儿童巨细胞病毒分离毒株的限制性酶切图谱分析

目的 调查幼儿园学龄前儿童间人巨细胞病毒 (HCMV)传播的分子流行病学状况。②方法 应用限制性核酸内切酶 ,对 112名幼儿园儿童尿标本分离到的部分HCMV毒株进行酶切图谱分析。③结果 自 2所幼儿园同组儿童分离到的大多数HCMV毒株具有相同的限制性酶切图谱。④结论 水平传播是幼儿园婴幼儿间HCMV传播的主要方式 。

甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)方法检测胃癌组织中抑癌基因甲基化的准确性,联合应用MSP方法与结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测抑癌基因甲基化状态的意义。方法采用MSP检测胃癌组织抑癌基因Runx3启动子区甲基化的状态,随后再采用COBRA检测胃癌组织标本的甲基化状态。分析两种方法检测结果的关系。结果经MSP方法检测54例肿瘤组织中共有30例标本发生Runx3基因启动子区异常甲基化,甲基化阳性率为55.6%。经COBRA方法检测54例肿瘤组织中有27例出现酶切条带即存在甲基化,甲基化阳性率为50.0%。经COBRA方法检测,在MSP方法检测的30例阳性标本中有3例未出现酶切条带即为假阳性。在MSP方法检测Runx3基因甲基化阴性的24例标本中,经COBRA方法检测,Runx3基因甲基化阴性的标本亦为24例。两种检测方法检测结果的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲基化特异性PCR方法在检测胃癌抑癌基因甲基化状态的研究中具有较高的灵敏度,COBRA方法可以检测出MSP方法中的假阳性标本,联合应用两种方法检测胃癌组织中抑癌基因的甲基化状态会使实验结果更可靠、准确。

应用限制性酶谱分析法快速检出Wilson病基因突变热点

目的建立Wilson病（WD）基因突变热点的快速检出方法，并探讨其在WD临床可疑患者诊断中的价值。方法PCR扩增我国WD基因的突变热区──第8号和12号外显子，分别以限制性内切酶MspI和TaiI消化扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳分离，得出相应限制性酶切图谱并进行分析。56例非同源家系的WD患者及60例正常对照进行了该项检测。其中44例同时进行这两个外显子的测序检测。结果37．5％（21／56）的WD患者在第8号外显子检测到Arg778Leu／Gln点突变，其中12例为纯合点突变，9例为杂合点突变，染色体突变频率为29．5％（33／112）。16．1％（9／56）的患者在第12号外显子检测到Thr935Met点突变，均为杂合点突变，染色体突变频率为8．0％（9／112）。结果与测序相符。结论采用限制性酶谱分析法可准确检出WD基因最常见的两个突变点，有助于对临床可疑患者进行诊断。并具有简便快速、结果清晰可靠、不需用同位素等优点，易于推广应用。

MMP-9与MMP-2在食管癌中的表达及其意义

目的 :阐明MMP 9(matrixmetalloproteinase 9)和MMP 2 (matrixmetalloproteinase 2 )在食管癌组织中的分布特点及其活性变化。方法 :采用免疫组织化学法和酶谱法 (Zymography)分别检测食管癌组织中MMP 9和MMP 2蛋白的分布及其活性。结果 :MMP 9和MMP 2在食管癌组织中的分布呈多样性 ,既存在于癌细胞中 ,也存在于成纤维细胞和组织巨噬细胞中 ;在角质细胞以及细胞间隙中也发现存在着MMP 9和MMP 2蛋白。在食管癌组织、癌旁组织和远端食管组织中存在着各种形式的MMP 9(130× 10 3-异源二聚体、92× 10 3-前酶形式和 84× 10 3-活性形式 )和MMP 2 (72× 10 3-前酶形式和6 2× 10 3-活性形式 )。 84× 10 3(活性形式 )的MMP 9以及 72× 10 3(前酶形式 )和 6 2× 10 3(活性形式 )的MMP 2在食管癌组织中的活性明显比癌旁组织和远端食管组织中的强 (P <0 0 5 )。结论 :MMP 9与MMP

重组脂联素真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建重组人脂联素 (ADPN)真核表达质粒 ,为进一步研究ADPN的功能提供实验基础。方法 应用限制性内切酶双酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD18 T和真核表达质粒pcDNA 3 1+ ,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒 ,经连接、转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆 ,经酶切和核苷酸序列测定鉴定。结果 重组真核表达质粒经HindⅢ、EcoRⅠ酶切后获得 5 4kb和 80 0bp两个片段 ,大小与理论值一致 ,并经核苷酸序列测定证实。结论 成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒。

麻疹样发疹患者柯萨奇B型病毒检测

目的:检测长春春季流行性皮肤斑丘疹患者外周血中柯萨奇B型病毒。方法:取56例春季流行性麻疹样发疹患者外周血标本,扩增目的DNA并进行特定限制性内切酶分析。结果:56份标本全部呈柯萨奇B6型病毒阳性。结论:柯萨奇B6型病毒可能是春季流行性麻疹样发疹的病原体。

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。

UP-PCR结合RFLP对脑脊液标本中病原菌的检测

①目的 建立通用引物聚合酶链反应 (UP PCR)结合限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)酶切图谱分析快速检测脑脊液标本中常见病原菌的方法。②方法 通过对体液标本中常见病原菌 16SrRNA基因保守区的序列分析 ,设计通用引物 ,对不同细菌的DNA进行UP PCP扩增 ,确定标本是否有细菌感染 ,然后对阳性标本的扩增产物分别用不同的限制性内切酶酶切 ,进行RFLP分析 ,进一步鉴定细菌。并与常规细菌培养鉴定法进行比较。③结果 UP PCR结合RFLP法最低可检测出 8cfu·mL-1大肠埃希菌和 2 5 0cfu·mL-1金黄色葡萄球菌 ;该法对10 2份脑脊液标本的检测中 ,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 92 .3%、96 .6 %、80 .0 %和 98.0 % ,较培养法好。④结论 该方法可以准确、快速地检测出脑脊液标本中感染的病原菌。

40例α地中海贫血的实验诊断及基因型

在2992例贫血原因待查者中,采用血红蛋白生化分析,诊断α地中海贫血40例,其中,HbH 14例,HbH-Bart′s 9例,α地中海贫血1 12例,α地中海贫血2 5例。继采用限制性内切酶图谱分析结合聚合酶链反应技术,检出基因型:--SEA/-α3.723例,--SEA/αα12例,αα/-α3.75例。

MeCP2基因热点突变分析在Rett综合征诊断中的应用

目的 探讨MeCP2基因常见突变是否对Rett综合征临床诊断有帮助。方法 对 2 3例Rett综合征患儿 ,部分患儿家长和 4名正常女性分别提取外周血基因组DNA。采用PCR方法扩增MeCP2基因第 3外显子nt2 2 6 4 3～nt2 30 2 2片段 ,限制性内切酶HphⅠ和NlaⅢ酶切分析T15 8M和R16 8X突变 ,6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检验酶切结果 ,突变点经DNA直接测序证实。结果 2 3例Rett综合征患儿中 4例有T15 8M突变 ,2 1例患儿中 2例有R16 8X突变。在患儿双亲及正常女性对照均未发现以上 2种突变。结论 T15 8M和R16 8X 2个突变在Rett综合征均较多发。PCR产物的限制酶分析 ,方法简便、快捷 。

多种基因分型技术在识别结核分枝杆菌基因型的联合应用

目的评价MTB散在分布重复单位（MIRUs）和IS5110限制性内切酶片段长度的多态性（IS6110-RFLP）基因分型技术，以及两者联合应用在我国华东农村地区MTB分子流行病学研究中的应用及其效果。方法以人群为基础的横断面研究设计，采用比例法确定2004-2005年从浙江省德清县和江苏省灌云县收集的351株MTB菌株的耐药性，利用间隔区寡核苷酸分型方法识别北京基因型MTB，并进行MIRUs和IS6110-RFLP独立基因分型和串联联合应用。结果先对351株MTB菌株采用MIRUs基因分型可以识别235种基因型，包括46个成簇基因型和189个惟一基因型，分辨力为0．9317；用IS6110-RFLP可进一步从成簇基因型中识别出28个亚组，分辨力为0．9989。相对而言，先对目标菌株采用IS6110一RFLP基因分型，可识别267基因型，分辨力为0．9684，包括46个成簇基因型和221个惟一基因型，再用MIRUs基因分型技术可进一步从成簇基因型中识别出31个亚型，分辨力为0．9992。两种顺序不同联合分型方法的基因分型的辨别能力相似，尤其是在耐多药MTB（分辨力分别为0．9965和0．9963）及北京基因型MTB（分辨力分别为0．9930和0．9933）的分型中。结论MIRUs分型的方法简便、快速，结果有效、可靠，在大规模的结核病分子流行病学研究中，可先采用MIRUs，再对成簇MTB菌株进行IS6110-RFLP二次分型的联合分型策略。

自发性癫癎大鼠脑内电压门控钠通道亚型mRNA的研究

目的对照研究自发性癫癎大鼠(SER)和正常Wistar大鼠(WTC)脑内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型钠通道α亚基mRNA表达情况。方法提取枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区组织总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及建立限制性内切酶图谱检测Ⅰ、ⅡA、ⅡN、ⅢA和ⅢN型钠通道的表达。结果SER枕叶皮质、齿状回及海马CA1和CA3区总钠通道(3.179±1.967、3.009±2.364、3.071±2.036、1.440±0.761)的表达略高于WTC(2.112±1.454、1.474±1.257、2.198±0.978、1.399±0.853),但差异均无统计学意义(P>0.05),SERⅢ型钠通道在海马的表达(1.066±0.276)高于WTC(0.419±0.098),且P<0.01,酶切图谱显示ⅢN型钠通道表达水平有明显上调。结论SER脑内海马Ⅲ型电压门控钠通道N亚型表达上调。