新型内表面反相限进填料的制备与评价

通过在硅烷化硅胶内表面和外表面分别键合己胺和聚乙烯醇,制备了能够在线直接进样分析生物样品的新型内表面反相限进填料。采用元素分析、电镜观察对该限进填料的结构进行了表征。以普萘洛尔、阿替洛尔、苯巴比妥、卡马西平作溶质探针,并以Merck公司生产的限进填料柱作参比,对合成的限进填料的色谱性能进行了研究。研究结果表明,所制备的限进填料有较好的蛋白质排阻能力、富集能力和反相色谱性能,能同时实现排阻生物大分子杂质和富集小分子被分析物的功能,可作为在线、快速直接进样检测分析生物样品的预处理柱,适用于普萘洛尔血浆的直接进样分析。

限进填料及其在生物样品分析中的应用

限进填料是一类特殊的萃取介质,允许生物基质直接、反复进样分析,实现待测物质的纯化和富集。限进填料萃取是生物分析领域的一种快速、简便、准确的在线样品制备方法。本文就限进填料的原理、种类及其在生物样品分析中的应用进行了综述。

限进填料高效液相色谱法测定人血浆中特布他林的浓度

目的:建立直接进样测定人血浆中特布他林浓度的限进填料(RAN)高效液相色谱(HPLC)方法。方法:直接进特布他林血浆样品到液相色谱系统测定其浓度。色谱柱为限进填料柱(150mm×4.6mm,5μm),柱温:40℃,流动相:甲醇-0.05mol·L^(-1)辛烷磺酸钠溶液(含0.005mol·L^(-1)磷酸二氢钠并用磷酸调 pH 至3.5)(5:95),流速:0.8mL·min^(-1),进样量:20μL,荧光激发波长280nm,发射波长为309nm。结果:平均回收率为94.50%,线性范围为1～40μg·mL^(-1)(r=0.9996)。日内和日间的 RSD 分别为0.96%～4.38%,1.41%～4.67%。最低定量浓度为0.1μg·mL^(-1)。结论:本法简便、快速、准确,适用于特布他林的血药浓度测定及其药动学研究。

限进介质作为柱切换填料的高效液相色谱法测定人血中羟基喜树碱含量及其药动学研究

目的 建立一个简单、快速、灵敏的柱切换高效液相色谱法(HPLC)测定人血清中l0-羟基喜树碱(HCPT)含量。方法 生物样品首先在装有限进介质(RAM)填料的预柱中净化和富集，然后转移到C18分析柱分析待测物，用荧光检测。结果 整个分析时间8min。在l～l000ng／ml浓度范围内，HCPT显良好的线性关系，日内、日间变异<5％，最低检测限为O．1ng／ml。结论 本法应用于临床病人注射HCPT后的药代动力学研究，结果符合一房室模型并计算出它的药动学参数。

通过柱切换技术与高效液相色谱联用的限进性柱对盐酸贝那普利的在线富集性能

以自制的限进性填料柱为预处理富集柱,Luna C18柱为分析柱,通过柱切换技术将限进性填料柱与高效液相色谱联用(RAM-HPLC),研究了盐酸贝那普利的在线富集效果。考察了进样体积与峰面积、系统总压力的关系,以及常规进样与大体积进样的差别。当进样体积在100μL以内时,峰面积随进样体积的增加而增加;当进样体积大于80μL时,系统总压力变化明显。考虑对整个系统的保护,选择80μL作为最大进样体积。同一浓度的样品进样20μL与进样80μL所得峰面积之间的线性关系良好。RAM柱对盐酸贝那普利具有良好的富集作用,能够有效提高HPLC的灵敏度,而且具有简单、经济的特点。

在线样品预处理限进色谱测定人血清中多奈哌齐浓度

目的通过在线样品预处理限进色谱柱切换技术建立一种测定人体血清中多奈哌齐血药浓度的高效液相色谱法。方法样品预处理采用LiChroCART(25mm×4mm,25μm)限进预柱,分析柱为Microsorb-MV C_(18)柱(150mm×4.6mm,4μm),以水-乙腈(99:1,v/v)为血浆蛋白冲洗流动相,流速2ml/min,0.02M磷酸缓冲液-乙腈-三乙胺(65:35:0.1,v/v/v)为分析流动相,流速1ml/min,检测波长315nm。结果本方法线性范围为0.02～1.0μg/ml,r=0.9995,日内、日间精密度RSD小于7%,回收率为87.9%～91.1%。结论该方法准确、稳定;灵敏度高,适用于多奈哌齐药物动力学及生物利用度的研究。

限进液相色谱法同时测定人血浆中拓扑替康内酯型和羧酸型的浓度

目的:使用限进填料液相色谱法,建立一个直接进样同时测定人血浆中拓扑替康内酯型和羧酸型浓度的方法。方法:限进填料色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱温:40℃;流动相:甲醇-0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(含1%三乙胺,pH6.6)=13:87(v/v);流速:1ml/min;进样量:20μl;荧光检测λex390nm/λem520nm。结果:平均回收率为94.50%,校正曲线线性范围为15~1000ng/ml。日内和日间RSD均<7%。由分析结果推得的动力学方程显示,37℃时在人血浆中拓扑替康内酯型和羧酸型为一级动力学过程,由此可进一步外推出采样时刻拓扑替康内酯型和羧酸型各自的浓度。结论:本法准确、快速,适用于拓扑替康两种结构的血药浓度同时测定及其药动学研究。

限进填料在生物样品直接分析中的应用

主要介绍限进填料(restricted access media,RAM)的原理、特点及分类。并且按照限进填料用于生物样品分析的方式,从单柱系统及柱切换的角度,介绍了限进填料在生物样品直接分析中的研究现状。

柱切换高效液相色谱法测定人血浆中替米沙坦浓度

目的:建立柱切换高效液相色谱(HPLC)法直接进样测定人血浆中替米沙坦浓度。方法:血浆样品直接进样,经限进填料(RAM)预柱用甲醇-水(10:90)在线净化和富集,然后洗脱切入 C_(18)分析柱用甲醇-水(63:37)进行分离,荧光检测λ_(ex)302nm/λ_(em)365nm。结果:标准曲线线性范围10～2000μg·L^(-1)(r=0.9995);回收率为95.4%～97.7%(n=5);日内 RSD 为0.2%～2.6%(n=5),日间 RSD 为2.1%～4.1%(n=5);最低检测浓度为0.51μg·L^(-1)。结论:本法简便、可靠,适用于测定人血浆中替米沙坦浓度及其药动学的研究。

柱切换技术-高效液相色谱法快速检测大鼠血浆中的普萘洛尔对映体

建立了快速检测大鼠血浆中普萘洛尔对映体浓度的柱切换-高效液相色谱法。将自制限进填料柱作为预处理柱,通过直接进样方式,使普萘洛尔对映体在预处理柱上保留,同时除去血浆中的蛋白质等大分子;再通过柱切换技术,使普萘洛尔对映体在键合型纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralcel OD-RH)分析柱上得到手性拆分。通过条件优化,确定切换前预处理流动相为硼酸盐缓冲液(pH 8.5)-甲醇(95∶5,v/v),流速为1.0mL/min;切换后分析流动相为异丙醇-乙醇-0.2 mmo l/L硼酸盐缓冲液(pH 8.5)(30∶30∶40,v/v/v),流速为0.8mL/min;切换时间为3 min;柱温为25℃;检测波长为293 nm。普萘洛尔两对映体在25～500 mg/L的质量浓度范围内具有良好的线性关系(r=0.999 5),3个加标水平(50、100、250 mg/L)的平均回收率为97.89%～101.56%,日内和日间精密度均小于5%。该方法简便、快速、灵敏、准确,适于血浆样本中手性药物的药代动力学研究。

RAM-HPLC在线富集技术检测脑脊液中利福平的浓度

目的建立大体积直接进样的限进性液相色谱（RAM-HPLC）法,实现脑脊液样品的在线直接进样富集并检测脑脊液中的利福平。方法以自制限进性填料柱为前处理柱,Luna C18为分析柱,前处理流动相为水―甲醇（95∶5,V/V）,流速为1 m L/min,分析流动相为甲醇-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（60∶5∶35,V/V/V）,柱温为25℃,检测波长为254 nm。结果选择100μL为进样体积,其峰面积是进样量为20μL时的5.33倍,有效提高了HPLC的检测灵敏度。利福平在0.25~8μg/m L的浓度范围内浓度和峰面积具有良好的线性关系（r=0.9997）,LOD和LOQ分别为0.07μg/m L和0.25μg/m L,日内日间精密度均小于5%,低中高3个浓度下的空白加样回收率为87.69%~102.11%,测定给药（剂量为10 mg/kg）2 h后的人脑脊液中利福平浓度为0.29μg/m L。结论该方法简单快速,适用于脑脊液中利福平的富集检测,满足临床个体化用药指导。

基于RAM-HPLC在线富集技术检测大鼠血浆及尿液中的呋塞米

目的通过柱切换技术建立限进性填料柱-高效液相色谱法,实现在线直接进样并检测大鼠血浆及尿液中的呋塞米。方法以自制限进填料柱为预处理柱,Luna C18柱为分析柱,预处理流动相为水-甲醇（95∶5,V/V）,含体积百分数为0.1%的甲酸,流速为1 ml/min;分析流动相为血浆：甲醇-水（65∶35,V/V）,尿液：甲醇-水（55∶45,V/V）,均含体积百分数为0.1%的甲酸,流速均为1ml/min,柱温为25℃;检测波长为274 nm。结果呋塞米血浆样品在进样100μl时,富集效果良好,在0.1-3.2μg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系（r=0.9995）,尿液进样20μl,呋塞米浓度在0.5-32μg/ml范围内具有良好的线性关系（r=0.9991）,血样及尿样的三个加标水平下的平均回收率分别为101.82%-113.36%,98.75%-112.27%,日内日间精密度均小于5%。结论药代动力学参数AUC0→24为6.265μg/（ml·h）,t1/2为2.447 h,Cmax为1.414μg/ml;24 h内呋塞米的累积排泄率为32.50%-39.08%。本方法简单快速,适用于血浆及尿液中呋塞米的直接进样检测。

在线柱切换反相高效液相色谱法测定大鼠血浆丁螺环酮浓度及药代动力学研究

目的 利用在线柱切换反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定大鼠血浆丁螺环酮浓度及药代动力学.方法 以自制限进填料柱为预处理柱,Luna C18柱为分析柱,预处理流动相为水-甲醇（95∶5,V/V）,流速为1 ml/min;分析流动相为甲醇-5 mmol/L甲酸铵（75∶25,V/V）,流速为1 ml/min,切换时间为3 min,柱温为25℃;检测波长为283 nm.选取Wistar大鼠6只,禁食12 h,按15 mg/kg剂量给予丁螺环酮片剂灌胃,并于给药后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h经大鼠眼球后静脉丛采血0.5 ml,离心,取上清液进样,观察血药浓度-时间曲线下面积、半衰期（t1/2）、最大浓度（Cmax）、清除率（CLZ）.结果 丁螺环酮在0.2~4.8 μg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系（r=0.9993）,3个加标水平（0.3、0.6、2.4 μg/ml）的平均回收率为96.03%、104.67%、105.76%,日内和日间精密度均〈5%.血药浓度-时间曲线下面积AUC0→8为3.023 μg/（ml·h）,AUC0→∞为4.056 μg/（ml·h）,t1/2为3.944 h,Cmax为1.38 μg/ml,CLZ为3.712 L/（h·kg）.结论 RP-HPLC简便、快速、灵敏、准确,适用于血浆样品中丁螺环酮的药代动力学研究.

在线生物样品处理与LC-MS/MS联用新技术

1在线生物样品处理新技术概况 生物样品预处理是体内药物分析中的一个重要环节，也是分析中最困难、最繁琐的工作。在体内药物分析中，生物样品成分复杂，除被测组分外，往往含有大量内源性物质、代谢产物及共存药物等干扰物质，且被测组分的含量很低，要准确地测定生物样品中的药物浓度，必须除去妨碍测定的杂质，对样品进行预处理。

HPLC在线富集法研究高原药物呋塞米的药代动力学

目的建立柱切换技术和限进性填料柱-HPLC法，实现在线直接进样并检测大鼠血浆中的呋塞米含量。方法以自制限进填料柱为预处理柱，Luna C18柱为分析柱，预处理流动相为水-甲醇（95：5，V/VA），含体积百分数为0．1％的甲酸，分析流动相为甲醇-水（65：35，V/V），流速均为1ml·min-1，柱温为25℃；检测波长为274nm。结果呋塞米血浆样品在进样100m时，富集效果良好，在0．1～3．2Ixg·ml-1的浓度范围内具有良好的线性关系（r=0．9995），高、中、低（0．4、0．8、1．61μg·ml-1）3个浓度血样的平均回收率分别为111．31％、104．48％和99．76％，日内日间精密度均小于5％。结论本方法简单快速，适用于血浆中呋塞米的直接进样检测。

直接进样液相色谱法在生物样品分析中的应用

生物样品基质复杂,在色谱分析前先要除去其中的蛋白质等大分子物质,以免损害色谱柱。常用的前处理方法多为离线操作,耗时费力,还会造成样品损失和污染,而直接进样的方法能减少前处理步骤,并能有效预浓缩和净化生物样品。这一过程可以通过柱切换技术实现自动化,尽可能地减少了生物样品的前处理步骤和潜在的样品污染,提高方法的重现性。本文对目前生物样品的液相色谱分析方法中样品自动化处理的进展进行了综述。具体集中于直接进样技术,如限进性填料和其他自动化在线固相萃取过程,还包括新兴的对样品更具选择性的自动化萃取相技术,如分子印迹聚合物。并对这些方法和潜在的应用前景进行了简要讨论。

柱切换-高效液相色谱法快速监测癫痫患者卡马西平血药浓度

目的:建立快速监测癫痫患者血清中卡马西平血药浓度的柱切换-高效液相色谱法。方法:通过直接进样方式,利用自制限进填料作为预处理柱,除去血清中蛋白质等大分子杂质,卡马西平保留在预处理柱上;再通过柱切换技术,使卡马西平在分析柱上得到分析检测。通过条件优化,确定切换前预处理流动相为甲醇-水(5∶95),流速为1.2 mL·min-1;切换后分析流动相为甲醇-水(70∶30),流速为1.0 mL·min-1;切换时间为3 min;柱温:25℃;检测波长:240 nm。结果:卡马西平在0.05～20μg·mL-1范围内具有良好的线性关系(r=0.9994),3个浓度水平(2、8、12μg·mL-1)的平均回收率分别为100.5%、100.8%、99.3%,日内和日间精密度均小于5%。结论:本方法快速、简便、灵敏、准确,适用于癫痫患者日常临床血药浓度监测。

柱切换-高效液相色谱法与荧光偏振免疫法快速监测苯巴比妥血药浓度的比较

目的:比较柱切换-高效液相色谱法和荧光偏振免疫法快速监测卡马西平血药浓度的结果相关性,评价柱切换-高效液相色谱法用于苯巴比妥治疗药物监测的可行性。方法:收集兰州军区兰州总医院门诊共52例癫痫患者血样,在同一天内分别用柱切换-高效液相色谱法和荧光偏振免疫法同时测定苯巴比妥血药浓度。以柱切换-高效液相色谱法测定值(X),荧光偏振免疫法测定值(Y)进行相关回归分析和配对t检验。结果:柱切换-高效液相色谱法和荧光偏振免疫法测定值之间相关性良好,回归方程为:Y=0.995 3 X+0.046 2(n=52,r=0.999 0);测定值两者之间差异无显著性(P>0.05)。结论:柱切换-高效液相色谱法灵敏、简单、方便、可靠,且显著降低监测成本,可适用于广大医院临床血药浓度的常规监测。