随意引物聚合酶链反应在血链球菌菌种鉴定中的应用

目的探索一种利用随意引物聚合酶链反应(AP-PCR)来鉴定不同血链球菌的方法。方法利用25碱基的引物5'AAGAGAGGAGCTAGCTCTTCTTGGA3',对血链球菌染色体DNA进行AP-PCR检测。结果不同菌种的血链球菌DNA经AP-PCR扩增后,产生不同的DNA片段;用不同方法提取同种血链球菌DNA可以得到相的DNA片段。结论AP-PCR可用于对血链球菌群中不同菌种进行鉴定和分类。

随意引物聚合酶链反应在健康青少年口腔优势菌鉴定中的应用

目的:应用随意引物聚合酶链反应(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction,AP-PCR)来对健康青少年口腔优势菌进行鉴定。方法:经初步鉴定健康青少年口腔优势菌为血链球菌属后,用随机引物AP-PCR对优势菌进行扩增、检测。结果:经扩增后的健康青少年口腔优势菌的DNA片段与标准血链球菌ATCC10556的DNA片段相同。结论:应用AP-PCR技术可以对健康青少年口腔优势菌进行鉴定和分类。

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的:应用内转录间隔区(ITS)通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应(PCR)方法。方法:采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种(8株)念珠菌菌悬液进行PCR扩增。结果:两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌悬液扩增出种特异的DNA条带,而第2对引物其种特异性更强。结论:采用ITS通用引物结合快速PCR检测法,可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌,并能同时鉴定到种,这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。

随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株的研究

本文运用随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株，获得较满意结果。实验根据Ｍ１３噬菌体已知部分核酸序列，自行设计并合成了３条引物，在一定条件下扩增ＲＨ，ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ－１等４株弓形虫基因组ＤＮＡ，扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳分带。扩增带型显示４株受检的弓形虫株具有株间差异。

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文)

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。

用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的PCR(M-PCR)方法。方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、HmsI、nv基因,对164株鼠疫菌进行扩增。结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性。结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法。

用4对引物聚合酶链反应检验鼠疫菌的研究

目的以传统的“四步检验”法为“金标准”,用4对引物聚合酶链反应(PCR)检测鼠疫动物材料,从而探索一种鼠疫快速诊断的方法。方法毒力测定和4对引物PCR按常规方法进行。结果在150份动物材料中,传统的“四步检验”作为金标准共检出阳性62份,而PCR法共检出阳性52份,经χ2检验,差异无统计学意义(χ2=1.42,P>0.05)。PCR实验在4h内全部完成。结论4对引物PCR法具有快速、敏感等优点,可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。

随机引物聚合酶链反应用于鉴别嗜人按蚊不同地理株的初步研究

目的探讨嗜人按蚊是否存在亚种（或地理株）。方法应用随机引物聚合酶链反应技术（ＲＰ－ＰＣＲ），选用３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株、广东株的ＤＮＡ扩增片段进行分析并以中华按蚊江苏株作对照。结果中华按蚊和嗜人按蚊的扩增条带存在明显差别，３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株的扩增图谱均存在明显差异。结论 ＲＰ－ＰＣＲ显示嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株之间存在差异，但这种差异在嗜人按蚊种或种下分类上的意义有待进一步分析。

细菌随机引物聚合酶链反应分析中随机引物的筛选与反应体系的优化

目的 筛选出最佳随机引物并优化其反应体系用于 8种细菌的随机引物聚合酶链反应 (AP PCR)分析。方法 对 2 0 0条随机引物进行过筛 ,应用反应曲面设计 (RSD)进行AP PCR反应体系的优化。结果 8种细菌各有 1条最佳随机引物 ,相应的优化反应体系 (关键反应成分 )浓度差别较大 ,其中模板浓度差别最大达 10 0倍。结论 以最佳随机引物及优化反应体系 ,才可使AP PCR分型条件“标准”化。

重复序列引物聚合酶链反应追踪金黄色葡萄球菌所致医院感染

目的利用重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)追踪我院一起由金葡菌所致的医院感染。方法分离得到的50株金葡菌用PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定,苯唑西林-盐琼脂筛选MRSA表型；PCR检测其耐药基因mecA；rep- PCR作金葡菌基因分型。结果50株金葡菌中,22株mecA阳性,其中19株分离自患者标本。采用rep-PCR,50株金葡菌均出现9～11条带的电泳图谱,从而可分成11个不同的基因型。结论rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是在分子水平追踪医院感染病原菌较理想的工具。

四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应在SNP基因分型中的研究

目的探讨四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,tetra-primer ARMS-PCR)在SNP基因分型中的应用。方法利用人EXO1基因第10外显子C49T单核苷酸多态性为研究对象,以tetra-primer ARMS-PCR的原理设计四种引物进行扩增,从而对Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量及内外引物浓度比例4个因素进行优化。结果当反应体系的退火温度为51℃,Mg2+浓度、dNTP浓度分别为2.0mmol/L、0.1mmol/L,Taq酶用量为0.5U,内/外引物浓度为1/0.2μmol/L时,tetra-primer ARMS-PCR应用于该SNP位点的基因分型结果最佳。结论四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应是SNP基因分型的一种可行方法,但在应用时需对反应条件进行必要的优化。

用随机引物多态性DNA聚合酶链反应鉴别新的裂体吸虫X

目的 鉴定新的裂体吸虫χ的基因组 DNA。方法 应用随机引物多态性 DNA聚合酶链反应 (RAPD- PCR)对裂体吸虫χ(S.χ)和日本血吸虫 (S.j)的基因组 DNA进行分析鉴别。感染了S.χ和 S.j尾蚴的兔 4 5 d后杀死 ,各取成虫 5 0条 ,磨碎 ,用苯酚—氯仿抽提法提取基因组 DNA。反应在 PCR扩增仪上进行 ,应用 2 9个随机引物 ,1.4 %琼脂糖凝胶电泳后观察、照相。结果 2 9个引物中 2个引物 ,J0 1 碱基 CCCGGCATAA和 L1 2 碱基 GGGCGGTACT的扩增产物在两者间显示出明显的差异带。引物 J0 1 S.χ特异性条带 1条 ,S.j特异性条带 1条。引物 L1 2 S.χ特异性条带 3条 ,S.j特异性条带 1条。结论 S.χ和 S.j的基因组 DNA在 J0 1 和 L1 2 的 6个位点的序列有所不同 ,出现了差异带 ,这在种间进化方面有鉴别价值。

顺序特异性引物聚合酶链反应技术对HLA-DR DNA的分型

目的:应用顺序特异性引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)进行临床肾移植供受者HLA-DR位点DNA的分型。方法:设计并合成HLA-DR位点16对特异性引物和1对阳性对照引物,建立PCR-SSP法,对52份临床肾移植供受者的外周血淋巴细胞样本进行DR位点基因的分型。结果与微量PCR-SSP基因分型试剂盒分型方法比较。结果:所有临床样本的PCR-SSP基因分型均获得成功,结果与微量PCR-SSP基因分型试剂盒分型方法完全相同,分型时间3 h,特异性和重复性100％。结论:应用合成引物为临床肾移植供受者进行HLA-DR位点PCR-SSP基因分型简便快捷,重复性好,适合于临床应用。

基因组简并寡核苷酸引物聚合酶链反应的影响因素

目的:对影响现有微量基因组扩增方法———简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)的因素进行探讨。方法:针对现有DOP-PCR扩增过程中存在的影响产物产量和特异性的因素进行分析,分别从不同的DNA模板来源、模板梯度稀释与否以及DOP-PCR扩增产物是否采用低熔点胶回收去除干扰分析的小片段等方面进行研究,最后以特异性基因(FTCD和CBS)PCR扩增的结果作为评价指标,了解上述因素对DOP-PCR扩增的影响。结果:以小鼠单个卵细胞基因组为模板与以肝基因组DNA为模板相比,在产量上前者明显低于后者,特异性上两者相当。小鼠肝基因组DNA梯度稀释作为模板进行扩增的结果没有明显差异。与未经低熔点胶回收的DOP-PCR产物相比,经低熔点胶回收的DOP-PCR产物在常规PCR扩增反应中得到的产物特异性更好。结论:应用DOP-PCR方法进行扩增时,小鼠单个卵细胞可以用来进行DOP-PCR的扩增从而用于对特异性基因的检测,但是在扩增产量方面需要进一步的改进或优化。对现有DOP-PCR反应进行产物低熔点胶回收纯化,能够增加产物的特异性,效果满意。

任意引物聚合酶链反应对致病性地霉株间分型的鉴定

目的采用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)对部分致病性地霉进行分子生物学方面的鉴定。方法用E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取地霉菌基因组DNA,采用任意引物S034(5′-TCTGTGCTGG-3′),S040(5′-GTTGCGATCC-3′),S167(5′-CAGCGACAAG-3′),S368(5′-GAACACTGGG-3′)对临床上致病性白地霉、林生地霉皮损株和血液株的基因组DNA进行扩增,对各病原菌的DNA指纹的特征进行分析。结果扩增产物电泳分析发现不同种真菌的DNA经扩增后显示不同的DNA带型,尤其是使用引物S040,S167和S368扩增产生的DNA带型种间差异较明显;分离自不同感染部位的同种不同株真菌的DNA经扩增后显示的主要DNA带型也有明显差异,如使用引物S040和S368扩增产生的DNA带型种内差异较明显。结论以任意引物S034,S040,S167,S368为基础的AP-PCR技术可作为临床上致病性地霉的种间及种内鉴定的简单、快速、可靠的方法。

随机引物聚合酶链反应指纹法对变形链球菌标准株进行基因分型

:【目的】探索一种利用随机引物聚合酶链反应指纹法技术进行变形链球菌基因分型的方法。【方法】利用变形链球菌不同血清型标准株和通用引物 5′ TGCCGAGCTG 3′,研究了在不同条件下进行聚合酶链反应的结果 ,寻找满意的聚合酶链反应条件。【结果】找到了较为满意的聚合酶链反应条件 :94℃ 30s,36℃ 30s,72℃ 1min ,反应进行 45个循环。

顺序特异引物聚合酶链反应技术HLA－DR1，DR51组的基因快速分型

采用快速基因分型技术对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ１、ＤＲ５１组准确分型，为临床选择理想配型的供受者提供依据。根据核苷酸序列合成系列特异引物，借助ＰＣＲ技术，建立顺序特异引物聚合酶链反应方法（ＰＣＲ－ＳＳＰ）快速基因分型方法，对６９例肾移植供受者ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ１５、ＤＲ１６和ＤＲ１０分型，同时与血清学方法对比研究。分型结果采用限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交证实。结果：６９例供受者ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ５１组ＰＣＲ－ＳＳＰ分型均获成功，无假阳性和假阴性，总耗时５ｈ，分型结果经酶切分析和探针杂交证实符合。血清学分型耗时２４ｈ，误差率达３２．４％。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ５１组基因分型，具有快速、精确的特点，适合于临床应用。

用于聚合酶链式反应(PCR)引物设计的计算机程序

本文报道了两个用于PCR引物设计的计算机程序PCRDESN和PCRDESNA。PCRDESN程序主要从以下4个方面评价用户自己设计的一对引物的质量:(1)引物内的碱基反向重复或发夹结构,(2)两个引物之间的碱基互补配对,(3)两个引物之间的同源性,(4)引物的碱基组成及特点和T_m值计算。通过用多例文献发表的及本院有关实验室提供的引物对序列的验证,确定了程序的运算参数,证明该程序能较好地检验引物对的质量和解释某些PCR实验失败的原因。PCRDESNA程序采用逐级优化的方法和比PCRDESN所选用的更严紧的引物选择参数对用户提供的核酸序列进行快速检索,以确定所有可能的和合适的引物对。

用顺序特异引物聚合酶链反应技术行HLA-A抗原DNA分型

作者采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ），建立了汉族人群ＨＬＡ－Ａ位点ＤＮＡ分型方法。研究采用ＰＣＲ－ＳＳＰ对３４５例肾移植供受者样本ＤＮＡ行ＨＬＡ－Ａ位点基因分型均获得成功。共检出Ａ位点等位基因总数６３５个，其中纯合子５５例，杂合子２９０例；可准确分辨ＨＬＡ－Ａ位点等位基因２０个，无假阳性和假阴性出现，重复率１００％，总耗时５小时。分型结果经标准ＤＮＡ验证和美国加州大学配型中心双盲验证完全符合。与标准血清学方法比较显示，６９份血清学空白位点中１６份存在第二个位点，１３份血清学分型错误，血清学总误差率９．０％。由此表明，用该研究建立的ＰＣＲ－ＳＳＰ方法行ＨＬＡ－Ａ位点ＤＮＡ分型，具有高分辨度、高特异性和简捷快速的特点，分型结果较血清学方法更加精确可靠，适合于临床应用。