随机光学重构超高分辨显微镜的使用研究与共享管理

随机光学重构超高分辨成像技术(STORM)采用基于光控荧光分子的单分子定位算法,横向和轴向分辨率分别达到~20 nm和~50 nm。本文结合使用和管理经验,对超高分辨STORM显微镜的原理、软硬件组成和技术参数、样品制备方法、超高分辨图像采集的常用操作流程、环境要求、日常维护、共享平台管理、STORM显微镜的应用等方面加以介绍,并对进一步提高STORM时空分辨率进行展望。

随机光学重构显微镜在外泌体观察中的应用

目的探讨随机光学重构显微镜(STORM)在外泌体观察中的应用价值,并介绍外泌体在随机光学重构显微镜下的成像原理及方法。方法实验中在肾性甲旁亢患者原代培养的甲状旁腺细胞的培养液上清中加入EXOQUICK-TC外泌体沉淀剂来获取细胞培养上清中的外泌体,将外泌体膜表面的特异性跨膜蛋白CD63作免疫荧光标记后利用随机光学重构显微镜对外泌体行超高分辨率成像并测量外泌体直径。结果实验中随机光学重构显微镜成功的对继发性甲旁亢甲状旁腺细胞原代培养液上清中的外泌体行单分子定位、直径测量及超高分辨率成像。结论因随机光学重构显微镜具有独特的光学特性并突破了光学衍射极限的限制,较传统光学显微镜,能获得20～50 nm的分辨率,可对外泌体行单分子精确定位、直径测量、超高分辨率成像。基于STORM的成像优势,相信STORM及其他超高分辨率成像技术将在外泌体及外泌体参与的生物学过程的研究中发挥重要作用。

随机光学重构显微术及其应用研究进展

在光学显微成像领域,涌现出一批可以突破衍射极限的超分辨显微成像技术,极大地增强了人们研究亚细胞结构的能力。基于单分子定位技术的随机光学重构显微术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)具有易懂的成像原理、简单的工作方式以及超高的分辨率等特点,受到越来越多的研究者青睐。首先,介绍了单分子定位技术的原理,讨论了STORM光路的搭建,阐述了二维和三维STORM超分辨显微成像原理。其次,探讨了多色STORM以及STORM与电镜关联成像现状。最后介绍了STORM技术现阶段的应用进展。

基于艾里光片照明的随机光学重构显微系统的研制

基于单分子定位的随机光学重构显微镜(STORM)是观察亚细胞结构的重要工具,但是在实际应用中往往会受到多方面的限制。光片照明显微镜因为具有快速、高对比度、光损伤低等优点,在近些年也得到了快速的发展。但是传统的高斯光片照明因为会快速的发散而使成像的视野受到了限制,而艾里光束作为一种无衍射光束,表现出良好的传播不变性,应用在光片照明显微镜中可以获得更大的视野。研制了一套基于艾里光片照明的随机光学重构显微系统,并在100×100μm视野范围内实现对Thy1-YFP小鼠脑片进行连续光学切面的二维超分辨成像。

STORM原始图像和基于点扩散函数测量矩阵的压缩感知后处理方法

针对随机光学重构显微等超分辨率显微成像技术存在的图像采集重构慢、空间分辨率低、时间分辨率弱,基于点扩散函数测量矩阵的约束等距性差和重构效果不好等缺点,提出了随机光学重构显微(STORM)原始图像和基于点扩散函数测量矩阵的压缩感知后处理方法。仿真结果表明,该方法在不改变显微镜光学系统的前提下,通过对STORM原始图像和基于点扩散函数测量矩阵的后处理,能够大幅提高超分辨率显微成像的重构效果。

基于压缩感知STORM超分辨成像与像素的关系

针对基于压缩感知STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)超分辨成像效果差的不足,提出采用高分辨相机改善基于PSF测量矩阵性能的方法。该方法能够改善基于PSF测量矩阵的约束等距性(restricted isometry property,RIP),从而达到提高重构效果的目的。实验结果表明,采用高分辨相机后基于PSF(point spread function)测量矩阵的列不相关性更好,重构能力、定位准确度和识别率都得到极大改善。同时探讨了以传统指标体系评价基于压缩感知的超分辨重构质量的优劣和适用性。发现匈牙利法和质心法的组合方案较能反应真实的基于压缩感知的超分辨重构效果。

超分辨显微成像技术在活细胞成像中的应用与发展

超分辨显微成像技术(super-resolution microscopy,SRM)可以绕过光学衍射极限对成像分辨率的限制,让以前观察不到的纳米级结构实现可视化,这一重大研究进展推动了现代生命科学和生物医学研究的进步与发展.细胞是生物体的基本组成单位,对活细胞内部的细微结构和动力学过程进行研究是掌握生命本质必不可少的途径.但由于成像原理或条件的限制,早期的SRM技术在活细胞成像应用方面受到了不同程度的限制.近几年来,随着SRM和相关技术的发展,SRM在活细胞成像研究中的应用也越来越多.本文简要介绍目前常见的几种SRM技术的基本原理和特点,并在此基础上着重阐述它们在活细胞成像应用中所取得的最新研究进展和发展方向.

单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展

在生物医学领域,对纳米尺寸级别的微小生物目标进行精确定位研究具有非常重要的意义,而光学显微成像技术为此提供了强有力的工具。光学显微成像技术受到光学衍射极限的限制,难以分辨尺寸在衍射极限(<200 nm)以下的生物结构,无法直接获取微小生物结构信息,阻碍了生物医学的进一步发展。近年来,随着纳米分辨显微成像技术的出现,新型荧光探针的开发、成像系统与设备的不断发展及成像算法不断完善地深入结合,促进了光学衍射极限以下尺寸微观目标的研究。基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起,荧光探针的光物理性质直接决定着超分辨成像结果的好坏。因此,设计不同性能的荧光探针可以实现超精细结构的不同超分辨成像,为研究其生物学功能提供了有力的工具。本文着重围绕基于SMLM的原理、有机荧光探针的设计要求、用于SMLM的荧光探针种类及其生物应用等方面进行总结综述,指出了单分子定位成像上存在的不足,并对其发展方向进行了展望,希望为对超分辨成像研究感兴趣或初涉该领域的研究者提供成像理论与探针设计方面的帮助。

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。

基于噪声校正主成分分析的压缩感知STORM超分辨图像重构

随机光学重构显微(STORM)的时间和空间分辨率相互制约,难以实现活细胞的超分辨成像,且超分辨图像的后处理分析与重构算法对图像质量也有非常重要的影响。基于此,针对高密度标记与高采样率所导致的单帧图像中光斑重叠及过多的背景噪声,提出一种用于单分子定位显微成像的新型噪声校正主成分分析(NC-PCA)方法,对单分子定位显微成像采集的图像进行预处理后再进行定位重构,提高了现有定位方法的定位精度,同时还实现了重叠分子的区分定位,从而提高了生物样品的标记密度,改善了超分辨成像的时间分辨率,可为活细胞单分子定位成像提供技术支持。

超分辨荧光显微镜-显纳镜

2014年诺贝尔化学奖授予美国科学家Eric Betzig、德国科学家Stefan W.Hell和美国科学家William E.Moerner,表彰他们在"发展超分辨荧光显微镜"方面的贡献。超分辨荧光显微镜的出现,为深入研究生命过程的分子机制提供了新的工具和新的机遇。本文综述了三位获奖人发明的两种超分辨荧光显微镜的基本原理、方法发展和生物医学应用,并对国内相关研究进展作了简介。

超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究

超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。2014年诺贝尔化学奖颁发给超高分辨率显微技术领域的三位科学家,以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。超高分辨率技术的典型代表有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分子等细节信息可以被观察到,帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。

基于深度学习的细胞骨架图像超分辨重建

21世纪初诞生的超分辨光学成像技术在生命科学研究中发挥着巨大作用,极大地增强了人们探索微纳尺度亚细胞结构的能力,然而这些成像技术往往耗时长,成本高。如今,许多研究者致力于基于深度学习的图像超分辨重建算法的研究中。利用自主搭建的随机光学重构超分辨显微镜获得细胞微管骨架超分辨图像,然后采用双线性插值降采样法处理得到低分辨率输入图集,再分别使用传统的三次样条插值法和增强型深度超分辨率神经网络进行学习训练,实现低分辨率图像的超分辨重建。结果表明:通过深度学习所重建的各种降采样的图像效果均优于采用传统插值法得到的图像效果,尤其是二倍降采样重建图像在主观和客观评价指标上可比拟实验获得的微管骨架超分辨图像。基于增强型深度超分辨率神经网络的细胞骨架图像超分辨重建有望提供一种简捷、有效和高性价比的成像方法,可应用于对细胞骨架超微结构的快速预测。