随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株的研究

本文运用随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株，获得较满意结果。实验根据Ｍ１３噬菌体已知部分核酸序列，自行设计并合成了３条引物，在一定条件下扩增ＲＨ，ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ－１等４株弓形虫基因组ＤＮＡ，扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳分带。扩增带型显示４株受检的弓形虫株具有株间差异。

随机引物聚合酶链反应用于鉴别嗜人按蚊不同地理株的初步研究

目的探讨嗜人按蚊是否存在亚种（或地理株）。方法应用随机引物聚合酶链反应技术（ＲＰ－ＰＣＲ），选用３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株、广东株的ＤＮＡ扩增片段进行分析并以中华按蚊江苏株作对照。结果中华按蚊和嗜人按蚊的扩增条带存在明显差别，３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株的扩增图谱均存在明显差异。结论 ＲＰ－ＰＣＲ显示嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株之间存在差异，但这种差异在嗜人按蚊种或种下分类上的意义有待进一步分析。

细菌随机引物聚合酶链反应分析中随机引物的筛选与反应体系的优化

目的 筛选出最佳随机引物并优化其反应体系用于 8种细菌的随机引物聚合酶链反应 (AP PCR)分析。方法 对 2 0 0条随机引物进行过筛 ,应用反应曲面设计 (RSD)进行AP PCR反应体系的优化。结果 8种细菌各有 1条最佳随机引物 ,相应的优化反应体系 (关键反应成分 )浓度差别较大 ,其中模板浓度差别最大达 10 0倍。结论 以最佳随机引物及优化反应体系 ,才可使AP PCR分型条件“标准”化。

随机引物聚合酶链反应在检测变形链球菌基因多态性中的应用

随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)是一种DNA指纹技术,已成功应用于以往不能区分的菌株间的遗传变异,可以不需预知靶基因DNA结构顺序,而获得多态性DNA指纹图。随着AP-PCR技术的不断完善,其已被广泛应用于口腔变形链球菌的基因分型研究中。本文就采用AP-PCR技术对变形链球菌进行基因分型的相关研究进行综述。

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的:应用内转录间隔区(ITS)通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应(PCR)方法。方法:采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种(8株)念珠菌菌悬液进行PCR扩增。结果:两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌悬液扩增出种特异的DNA条带,而第2对引物其种特异性更强。结论:采用ITS通用引物结合快速PCR检测法,可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌,并能同时鉴定到种,这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文)

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。

用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的PCR(M-PCR)方法。方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、HmsI、nv基因,对164株鼠疫菌进行扩增。结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性。结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法。

用4对引物聚合酶链反应检验鼠疫菌的研究

目的以传统的“四步检验”法为“金标准”,用4对引物聚合酶链反应(PCR)检测鼠疫动物材料,从而探索一种鼠疫快速诊断的方法。方法毒力测定和4对引物PCR按常规方法进行。结果在150份动物材料中,传统的“四步检验”作为金标准共检出阳性62份,而PCR法共检出阳性52份,经χ2检验,差异无统计学意义(χ2=1.42,P>0.05)。PCR实验在4h内全部完成。结论4对引物PCR法具有快速、敏感等优点,可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。

应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 。

重复序列引物聚合酶链反应追踪金黄色葡萄球菌所致医院感染

目的利用重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)追踪我院一起由金葡菌所致的医院感染。方法分离得到的50株金葡菌用PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定,苯唑西林-盐琼脂筛选MRSA表型；PCR检测其耐药基因mecA；rep- PCR作金葡菌基因分型。结果50株金葡菌中,22株mecA阳性,其中19株分离自患者标本。采用rep-PCR,50株金葡菌均出现9～11条带的电泳图谱,从而可分成11个不同的基因型。结论rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是在分子水平追踪医院感染病原菌较理想的工具。

基因组简并寡核苷酸引物聚合酶链反应的影响因素

目的:对影响现有微量基因组扩增方法———简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)的因素进行探讨。方法:针对现有DOP-PCR扩增过程中存在的影响产物产量和特异性的因素进行分析,分别从不同的DNA模板来源、模板梯度稀释与否以及DOP-PCR扩增产物是否采用低熔点胶回收去除干扰分析的小片段等方面进行研究,最后以特异性基因(FTCD和CBS)PCR扩增的结果作为评价指标,了解上述因素对DOP-PCR扩增的影响。结果:以小鼠单个卵细胞基因组为模板与以肝基因组DNA为模板相比,在产量上前者明显低于后者,特异性上两者相当。小鼠肝基因组DNA梯度稀释作为模板进行扩增的结果没有明显差异。与未经低熔点胶回收的DOP-PCR产物相比,经低熔点胶回收的DOP-PCR产物在常规PCR扩增反应中得到的产物特异性更好。结论:应用DOP-PCR方法进行扩增时,小鼠单个卵细胞可以用来进行DOP-PCR的扩增从而用于对特异性基因的检测,但是在扩增产量方面需要进一步的改进或优化。对现有DOP-PCR反应进行产物低熔点胶回收纯化,能够增加产物的特异性,效果满意。

任意引物聚合酶链反应对致病性地霉株间分型的鉴定

目的采用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)对部分致病性地霉进行分子生物学方面的鉴定。方法用E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取地霉菌基因组DNA,采用任意引物S034(5′-TCTGTGCTGG-3′),S040(5′-GTTGCGATCC-3′),S167(5′-CAGCGACAAG-3′),S368(5′-GAACACTGGG-3′)对临床上致病性白地霉、林生地霉皮损株和血液株的基因组DNA进行扩增,对各病原菌的DNA指纹的特征进行分析。结果扩增产物电泳分析发现不同种真菌的DNA经扩增后显示不同的DNA带型,尤其是使用引物S040,S167和S368扩增产生的DNA带型种间差异较明显;分离自不同感染部位的同种不同株真菌的DNA经扩增后显示的主要DNA带型也有明显差异,如使用引物S040和S368扩增产生的DNA带型种内差异较明显。结论以任意引物S034,S040,S167,S368为基础的AP-PCR技术可作为临床上致病性地霉的种间及种内鉴定的简单、快速、可靠的方法。

随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。方法分别以乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应(PCR)检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理(模板为DNA)或反转录酶作用(模板为RNA)退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒为1×106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1×104拷贝/ml。结论成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。这种方法的建立为快速检测不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。

共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

应用顺序特异性引物聚合酶链反应检测华南人群HLA-B座位第4外显子变异

目的 为探明中国华南人群中因HLA B座位发生基因突变而引起表达变异存在的可能性。方法 用顺序特异性引物聚合酶链反应 (PCR SSP)对 75例经血清学分型为纯合型样本再次分型 ,对有差异的结果使用PCR SSP方法检测第四外显子突变情况。结果 75例血清学指定为纯合型标本经DNA分型证实有 1 2例为杂合型。 1 2例结果有差异的样本经PCR SSP法表达变异的筛查发现有 1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入 ,经DNA分型发现的第二基因为沉默基因。结论 应用PCR SSP方法可检测HLA B等位基因突变 ,该突变导致HLA B基因表达无效 ,进行HLA基因表达变异的检测可提高HLA分型的准确性 ,更加有效的指导临床进行器官和骨髓的选配。

任意引物聚合酶链反应鉴定皮肤癣菌研究

目的 探讨任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)和引物OPD18、OPAA11对常见皮肤癣菌进行分子水平鉴定的意义。方法 用任意引物OPD18(5'-GAGAGCCAA-3')和OPAA11(5'-ACCCGACCTG-3')对常见皮肤癣菌进行AP-PCR,并对扩增产物的DNA带型进行分析:结果 皮肤癣菌所试的7个菌种之间均产生具有明显差异的DNA带型。结论 用AP-PCR和引物OPD18、OPAA11可对常见皮肤癣菌进行分子水平鉴定。

一种多元聚合酶链反应的引物集选择算法

多元聚合酶链反应(multiplex PCR,MP-PCR)是一种运用多对引物同时扩增多条DNA序列或一条DNA序列上多个区域的生物学实验方法.引物集设计对于实验的成功至关重要.由于引物合成是实验成本的主要来源,且引物需要满足许多约束条件,因此设计满足多约束条件的最小引物集是保证实验成功、降低实验成本的有效手段.首先给出多约束最小引物集选择问题(minimum primer set selection problem with multiple constraints,MPSSPMC)的数学模型,通过引入新颖的遗传算子,提出一种求解该问题的单亲遗传算法MG-PGA.实验结果表明MG-PGA在满足多约束条件下能获得较小的引物集,为MP-PCR引物设计提供了一种有效的解决方法.

臆断引物-聚合酶链反应分析配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因组的差异基因

目的 研究同一胃腺癌患者的配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因差异 ,并对差异基因片段进行克隆 ,Southern印迹杂交。方法 应用随意扩增多态性DNA指纹图谱分析技术 (arbitrarilyprimerpolymerasechainreaction ,AP PCR) ,即臆断引物的无细胞分子克隆技术 ,亦称臆断引物的聚合酶链反应 ,对 5例配对标本作基因组差异分析。结果 与各自配对的非癌胃组织相比 ,所有胃腺癌组织基因组DNA的AP PCR指纹图谱均存在变异 ,并克隆了其中 1例仅存在于肿瘤组织基因组的差异扩增片段PW 2 .2。Southern印迹杂交发现此PW 2 .2也存在于其他部分胃腺癌标本的随机扩增产物中。结论 AP PCR技术可为差异基因分析和克隆提供一快速而有效的方法。

重复序列引物聚合酶链反应在检测肺炎克雷伯菌院内流行中的应用

目的 用重复序列引物聚合酶链反应（rep-PCR）方法分析从大连医科大学第一临床学院不同患者分离出来的肺炎克雷伯菌是否起源于同一菌株.方法 用微生物分析系统检测其对抗生素的敏感程度,选用肠杆菌科广泛存在的基因间重复片段为引物进行扩增,对肺炎克雷伯菌进行基因分型.结果 建立了rep-PCR法方法,显示可将肺炎克雷伯菌扩增出丰富的区带.分离到的33株产ESBL肺炎克雷伯菌分属6个基因型.结论 rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是分子水平追踪医院感染较理想的方法.

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。