随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株的研究

本文运用随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株，获得较满意结果。实验根据Ｍ１３噬菌体已知部分核酸序列，自行设计并合成了３条引物，在一定条件下扩增ＲＨ，ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ－１等４株弓形虫基因组ＤＮＡ，扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳分带。扩增带型显示４株受检的弓形虫株具有株间差异。

随机引物聚合酶链反应用于鉴别嗜人按蚊不同地理株的初步研究

目的探讨嗜人按蚊是否存在亚种（或地理株）。方法应用随机引物聚合酶链反应技术（ＲＰ－ＰＣＲ），选用３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株、广东株的ＤＮＡ扩增片段进行分析并以中华按蚊江苏株作对照。结果中华按蚊和嗜人按蚊的扩增条带存在明显差别，３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株的扩增图谱均存在明显差异。结论 ＲＰ－ＰＣＲ显示嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株之间存在差异，但这种差异在嗜人按蚊种或种下分类上的意义有待进一步分析。

细菌随机引物聚合酶链反应分析中随机引物的筛选与反应体系的优化

目的 筛选出最佳随机引物并优化其反应体系用于 8种细菌的随机引物聚合酶链反应 (AP PCR)分析。方法 对 2 0 0条随机引物进行过筛 ,应用反应曲面设计 (RSD)进行AP PCR反应体系的优化。结果 8种细菌各有 1条最佳随机引物 ,相应的优化反应体系 (关键反应成分 )浓度差别较大 ,其中模板浓度差别最大达 10 0倍。结论 以最佳随机引物及优化反应体系 ,才可使AP PCR分型条件“标准”化。

应用顺序特异性引物聚合酶链反应检测华南人群HLA-B座位第4外显子变异

目的 为探明中国华南人群中因HLA B座位发生基因突变而引起表达变异存在的可能性。方法 用顺序特异性引物聚合酶链反应 (PCR SSP)对 75例经血清学分型为纯合型样本再次分型 ,对有差异的结果使用PCR SSP方法检测第四外显子突变情况。结果 75例血清学指定为纯合型标本经DNA分型证实有 1 2例为杂合型。 1 2例结果有差异的样本经PCR SSP法表达变异的筛查发现有 1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入 ,经DNA分型发现的第二基因为沉默基因。结论 应用PCR SSP方法可检测HLA B等位基因突变 ,该突变导致HLA B基因表达无效 ,进行HLA基因表达变异的检测可提高HLA分型的准确性 ,更加有效的指导临床进行器官和骨髓的选配。

臆断引物-聚合酶链反应分析配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因组的差异基因

目的 研究同一胃腺癌患者的配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因差异 ,并对差异基因片段进行克隆 ,Southern印迹杂交。方法 应用随意扩增多态性DNA指纹图谱分析技术 (arbitrarilyprimerpolymerasechainreaction ,AP PCR) ,即臆断引物的无细胞分子克隆技术 ,亦称臆断引物的聚合酶链反应 ,对 5例配对标本作基因组差异分析。结果 与各自配对的非癌胃组织相比 ,所有胃腺癌组织基因组DNA的AP PCR指纹图谱均存在变异 ,并克隆了其中 1例仅存在于肿瘤组织基因组的差异扩增片段PW 2 .2。Southern印迹杂交发现此PW 2 .2也存在于其他部分胃腺癌标本的随机扩增产物中。结论 AP PCR技术可为差异基因分析和克隆提供一快速而有效的方法。

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

随机引物聚合酶链反应在检测变形链球菌基因多态性中的应用

随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)是一种DNA指纹技术,已成功应用于以往不能区分的菌株间的遗传变异,可以不需预知靶基因DNA结构顺序,而获得多态性DNA指纹图。随着AP-PCR技术的不断完善,其已被广泛应用于口腔变形链球菌的基因分型研究中。本文就采用AP-PCR技术对变形链球菌进行基因分型的相关研究进行综述。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的:应用内转录间隔区(ITS)通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应(PCR)方法。方法:采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种(8株)念珠菌菌悬液进行PCR扩增。结果:两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌悬液扩增出种特异的DNA条带,而第2对引物其种特异性更强。结论:采用ITS通用引物结合快速PCR检测法,可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌,并能同时鉴定到种,这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文)

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。

用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的PCR(M-PCR)方法。方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、HmsI、nv基因,对164株鼠疫菌进行扩增。结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性。结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法。

用4对引物聚合酶链反应检验鼠疫菌的研究

目的以传统的“四步检验”法为“金标准”,用4对引物聚合酶链反应(PCR)检测鼠疫动物材料,从而探索一种鼠疫快速诊断的方法。方法毒力测定和4对引物PCR按常规方法进行。结果在150份动物材料中,传统的“四步检验”作为金标准共检出阳性62份,而PCR法共检出阳性52份,经χ2检验,差异无统计学意义(χ2=1.42,P>0.05)。PCR实验在4h内全部完成。结论4对引物PCR法具有快速、敏感等优点,可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的 运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法 收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果 血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论 RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。

应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 。

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

重复序列引物聚合酶链反应追踪金黄色葡萄球菌所致医院感染

目的利用重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)追踪我院一起由金葡菌所致的医院感染。方法分离得到的50株金葡菌用PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定,苯唑西林-盐琼脂筛选MRSA表型；PCR检测其耐药基因mecA；rep- PCR作金葡菌基因分型。结果50株金葡菌中,22株mecA阳性,其中19株分离自患者标本。采用rep-PCR,50株金葡菌均出现9～11条带的电泳图谱,从而可分成11个不同的基因型。结论rep-PCR是一种快速、简便、可靠的基因分型方法,是在分子水平追踪医院感染病原菌较理想的工具。