大肠杆菌Nissle 1917隐秘质粒消除方法的建立

质粒消除旨在获得无质粒菌株,是对益生菌进行遗传改造所需的一项重要技术。本试验建立在质粒不相容性的基础上,引入自杀性载体pRE112作为辅助工具,使用分子生物学方法构建重组自杀质粒pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,将其分别导入携带2个大隐秘质粒pMUT1和pMUT2的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN),利用重组自杀质粒去除EcN内原有隐秘质粒并在含有10%蔗糖的LB培养基上实施自杀质粒自身消除。结果试验成功获得EcN无质粒克隆菌株(Escherichia coli Nissle 1917cured of its two cryptic plasmids pMUT1and pMUT2,EcNc),为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定基础。

芽孢杆菌基因工程新载体的构建

利用从Bacillus pumilus 289中分离出的隐秘质粒pNK289(7.2kb)的复制起始调控区及启动区DNA片段和质粒pPL 601上的氯霉素乙酰基转移酶结构基因(cat-86),构建了能在B.subtilis和B. pumilus中稳定传代的质粒pNQ216(4.1kb)和pNQ402(2.8kb)。在非诱导条件下,其在含Cm的LB平皿上的外显率都比pPL600高约30％,可以用作芽孢杆菌基因克隆的质粒载体。