利用蛋白质组学技术研究拟南芥隐色素突变体cry1的差异表达蛋白

隐色素是一类蓝光受体蛋白,在动植物中调节各种光反应.在拟南芥中隐色素是核蛋白,通过蓝光调节控制下胚轴的伸长,子叶的延展,光周期诱导开花以及生物钟.拟南芥隐色1(CRY1)是一种蓝光受体,主要调节下胚轴的伸长,但CRY1下游的光化学反应仍然不清楚.拟南芥隐色素突变体cry1-304和野生型col-4在蓝光条件下,经过7 d的生长,cry1-304的下胚轴的长度比野生型col-4的下胚轴长.为了弄清楚拟南芥蓝光受体隐色素在调节植物生长发育中的机制,采用双向电泳这种蛋白质组学的方法来分离对比cry1-304和野生型col-4在蛋白水平的表达变化.选取了15个差异蛋白质点,采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,其中10个蛋白质点得到鉴定和分析,它们包括一些普通酶、氧化还原酶、转录因子、结合蛋白、热休克蛋白等.

生物钟基因隐花色素-1与精神分裂症核心家系的单体型相对风险分析

目的探讨精神分裂症与生物钟基因隐花色素-1(Cryptochrome-1,Cry1)的关系。方法检测100个精神分裂症核心家系的Cry1基因上的rs2300448-rs1921135和rs1056560三个多态性位点,并进行单体型相对风险分析(HHRR)。结果HHRR结果显示,rs2300448多态性由父母传递给患病子女的等位基因(G/A)频率差异有统计学意义(P<0.05),等位基因G优先传递给患病子女;而rs1056560和rs1921135的等位基因传递频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论Cry1基因可能与中国汉族精神分裂症相关联。

NF-κB信号通路介导CRY1基因甲基化促进急性髓系白血病预后的机制研究

目的 检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中隐色素1(cryptochrome 1,CRY1)甲基化状态,探讨CRY1甲基化与AML预后的相关性,进一步探讨其促进AML预后的相关机制。方法 培养THP-1细胞,收集58例AML患者(AML组)及23例正常健康人(正常组)骨髓标本,进行基因组DNA及RNA提取。甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)方法对CRY1基因进行甲基化检测。逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)和Western blot分别对CRY1、核因子κB p65(nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)、磷酸化核因子κB p65(phospho-nuclear factor kappa-B p65,p-NF-κB p65)及核因子κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB,IκBα)基因和蛋白的表达进行检测。结果 AML组患者的CRY1启动子甲基化率高于正常组(P<0.05)。异常核型AML患者CRY1基因甲基化率和CRY1 mRNA表达分别低于和高于正常核型AML患者。CRY1的甲基化阳性率在不同年龄、性别和FAB分型方面差异无统计学意义(P>0.05)。CRY1甲基化组CRY1、NF-κB p65、p-NF-κB p65及IκBα的mRNA和蛋白相对表达量较CRY1未甲基化组均明显下降(P均<0.05)。结论 AML患者CRY1启动子甲基化下调CRY1 mRNA表达,通过抑制NF-κB的抗凋亡作用,影响细胞增殖与凋亡,促进AML的预后。

生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞表型蛋白标志物变化

目的探讨生物钟(circadian clock)相关蛋白隐花色素1(CRY1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用。方法将VSMCs分为对照(control)组和实验组,用不同浓度AngⅡ处理VSMCs不同时间,RT-PCR和Western blot检测收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、合成型标志物骨桥蛋白(OPN)及CRY1 mRNA和蛋白的表达;分别构建CRY1的干扰RNA(siCRY1)、YAP1的干扰RNA(siYAP1)进行基因沉默,构建CRY1的过表达质粒(pcDNA-CRY1)进行过表达,RT-PCR、Western blot双重验证各基因组mRNA和蛋白的表达;将VSMCs分为4组,对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siCRY1组、AngⅡ+pcDNA-CRY1组,将siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1转染至经AngⅡ处理VSMCs中,RT-PCR和Western blot检测α-SMA、OPN、CRY1、YAP1 mRNA和蛋白的表达及CCK-8法检测细胞增殖情况。结果不同浓度AngⅡ刺激VSMCs不同时间后,VSMCs收缩型标志物表达减少,VSMCs合成型标志物表达增加,CRY1表达减少;转染siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1处理VSMCs后,CRY1在siCRY1组中表达下降,在pcDNA-CRY1组中表达升高,YAP1在siYAP1组中表达下降,在siCRY1组中表达升高;转染siCRY1进一步减少AngⅡ诱导VSMC收缩型标志物的表达(P<0.05),增加合成型标志物、YAP1的表达,以及促进VSMCs的增殖(P<0.05);转染pcDNA-CRY1质粒增加AngⅡ诱导VSMCs收缩型标志物的表达(P<0.05),减弱合成型标志物YAP1的表达(P<0.05)及抑制VSMCs的增殖(P<0.05)。结论生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉VSMCs表型蛋白标志物变化和增殖,该过程可能与Hippo-YAP信号通路有关。

隐花色素-1基因与精神分裂症核心家系的传递不平衡分析

目的探讨精神分裂症与隐花色素-1(Cry1)基因多态性的关联关系。方法应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术对100个精神分裂症核心家系的 Cry1基因上的多态性位点 rs2300448、rs1921135和 rs1056560进行多态性检测;用 Genehunter2.1软件包进行传递不平衡分析(TDT),并构建可能的单体型。结果 (1)rs2300448多态性位点等位基因 G 和等位基因 A 传递给患病子女的频率差异有统计学意义,等位基因 G 优先传递给患病子女(x^2=4.92,P=0.027),但 P 值经Bonferroni 校正后,差异无统计学意义(Pc=0.054);rs1056560和 rs1921135多态性位点未发现传递不平衡现象(x^2=0.15,P=0.698;x^2=0.56,P=0.456)。(2)单体型 rs 2300448-rs1056560G-A(x^2=6.76,P=0.009)、rs1921135-rs2300448-rs1056560T-G-C(x^2=4.50,P=0.034)和 C-G-A(x^2=6.37,P=0.012)存在传递不平衡现象,但 P 值经 Bonferroni 校正后,T-G-C 和 C-G-A 差异均无统计学意义(P>0.05),只有单体型 rs2300448-rs1056560G-A 差异有统计学意义(Pc=0.036)。结论 Cry1基因可能与精神分裂症相关联。

隐花色素基因1在骨肉瘤细胞中的作用

目的探讨在人骨肉瘤细胞中沉默隐花色素基因1(CRY1)的作用及其机制。方法将靶向CRY1基因的携带短发夹RNA(shRNA)表达的质粒通过慢病毒载体转入人骨肉瘤细胞株(HOS),以沉默人骨肉瘤细胞中CRY1基因。应用Western blot检测HOS细胞中CRY1基因的敲低效果;应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验明确CRY1基因敲低对骨肉瘤细胞生长的影响;应用Western blot技术检测CRY1下游基因的表达变化;应用实时荧光定量聚合酶链反应检测关键生物钟基因CRY1、隐花色素基因2(CRY2)、Period基因(PER1、PER2)、BMAL1、CLOCK mRNA的表达水平。结果CRY1沉默组(0.839±0.020)较对照组(0.553±0.019)生长加快(P<0.01),并且经典Wnt通路抑制分子糖原合成酶-3β(Gsk-3β)的磷酸化水平沉默组(1.105±0.052)较对照组(0.449±0.061)升高而导致其降解增加(P<0.01),关键分子β-连环蛋白(β-catenin)的核内水平对照组(0.729±0.067)较沉默组(1.119±0.018)升高(P<0.01);同时,HOS细胞中除CRY1基因的mRNA水平降低外,其余生物钟基因mRNA水平均升高;此外,挽救实验中HOS细胞生长受抑制(对照组:1.012±0.151,沉默组:1.483±0.095,过表达组:0.541±0.129,P<0.01)。结论隐花色素基因CRY1能通过经典Wnt通路抑制骨肉瘤细胞的生长,并能影响生物钟网络关键基因CRY2、PER1、PER2、BMAL1、CLOCK的表达,提示该基因在骨肉瘤细胞中具有重要的调控作用。