人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.

隐花色素蛋白光依赖磁感应机制研究进展

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,在植物中主要调节生长及发育,是果蝇等昆虫光信号的接收者,在哺乳动物中扮演调节生物钟的角色。CRY蛋白作为磁光信号感受器受到广泛关注,其结构中的保守的色氨酸三联体与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)间自由基电子对是CRY蛋白具有光依赖的磁感应功能的关键因素。该文对CRY蛋白的分类及结构特征、光依赖磁感应机制的研究进展进行了综述,并对目前CRY蛋白研究中存在的问题及未来研究方向进行了展望。

隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白相互作用及其在褐飞虱发育与生殖中的作用

【目的】在真核生物中验证隐花色素蛋白(Cryptochrome)/铁硫簇蛋白(Iron-sulfur cluster assembly1)的相互作用,研究2种蛋白在褐飞虱Nilaparvata lugens发育和生殖过程中的作用,为二者在磁感受机制中的协同作用及磁场对昆虫生理状态的调控机制提供依据和新的研究方向。【方法】通过酵母双杂交系统对褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白/Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白的相互作用进行验证。在褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi(RNA interference)沉默模型,并采用RT-qPCR检测2个基因沉默效率,统计沉默虫体的若虫历期和产卵量。【结果】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白存在相互作用,而Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白不存在相互作用。褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中成功建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi沉默模型,在注射dsRNA后第2天、第4天和第6天时,2个基因的沉默效率均能达到70%以上。Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因沉默虫体的若虫历期无明显变化,但是产卵量受到显著性抑制。【结论】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白存在相互作用,二者在褐飞虱生殖过程中发挥重要作用。