山羊隐花色素2基因真核表达载体的构建及生物信息学分析

为了构建山羊隐花色素2(CRY 2)基因的真核表达载体,分析CRY2蛋白的基本特性,本试验采用逆转录PCR扩增山羊CRY 2基因的编码序列(CDS),并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体,获得pcDNA3.1-3HA-gCRY2重组质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HEK293T细胞,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测山羊CRY 2基因在mRNA和蛋白水平的表达变化;同时利用生物信息学软件对CRY2蛋白的基本理化性质和功能进行预测和分析。结果显示:pcDNA3.1-3HA-gCRY2重组质粒的酶切和测序结果与预期一致;转染HEK293T细胞后,pcDNA3.1-3HA-gCRY2转染组CRY 2 mRNA的相对表达量比pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组高600倍左右(P<0.001),CRY2蛋白成功表达;山羊、小鼠和人等哺乳动物CRY 2基因CDS区具有较高的相似性;CRY2蛋白不存在信号肽和跨膜区,预测显示其可能与ARNTL、CLOCK、PER1和PER2等蛋白互作。结果表明,本试验成功构建了山羊CRY 2基因的真核表达载体,并预测分析了山羊CRY2蛋白的基本理化特性,为探究山羊CRY 2基因及其编码蛋白的生物学功能提供了科学依据。

隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

隐花色素是植物向光反应的主要的光受体,介导蓝光/近紫外光调控的反应。在拟南芥中CRY2调节去黄化反应并控制开化时间。我们根据在GenBank中已经发表的拟南芥(NM_100320)、中国大白菜(AY176689)、油菜(AJ889779)CRY2基因的cDNA保守序列设计并合成同源引物。通过RT-PCR方法从"津田"芜菁(Brassica rapa L.subsp.rapa"Tsuda")总RNA中扩增出CRY2基因的cDNA部分片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR221中。测序表明,该片段与拟南芥具有87%的同源性,与油菜和中国大白菜的同源性达97%以上。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pH7GWIWG2(I)为基础,构建了由组成型启动子35S调控的CRY2基因的ihpRNAi植物表达载体。

芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究

[目的]研究芥菜Cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化,为后期对两者关系的进一步研究提供参考。[方法]在克隆芥菜类茎瘤芥Cry2基因的基础上,构建该基因的RNAi载体,并导入根瘤农杆菌GV3103,获得工程菌株后,通过农杆菌浸染茎瘤芥子叶外植体进行植物体转化,并验证转化结果。[结果]成功构建了茎瘤芥Cry2基因的RNAi载体,并建立了茎瘤芥遗传转化体系,获得了转基因植株。[结论]茎瘤芥Cry2 RNAi的构建及遗传转化体系的建立为后期深入研究茎瘤芥熟期相关基因的功能及基因工程应用奠定了基础。