小鼠Usp25基因的雄激素反应元件的克隆与功能鉴定

目的我们前期研究中进行全基因组表达谱检测发现在雄激素受体（androgen receptor，Ar）基因睾丸支持细胞特异性敲除小鼠（S-Ar^-/y）睾丸组织中泛素特异性蛋白酶25（ubiquitin specific peptidase 25，usp25）基因表达较低。本研究的目的是了解雄激素及其受体是否可以作用于Usp25基因，并测定其雄激素反应元件（androgen-responsive element，ARE）。方法采用RT-qPCR方法检测Usp25基因表达量。通过生物信息学预测脚25基因上游可能的ARE，构建Usp25基因ARE报告质粒pGLP／Usp25。在TM4细胞中，采用荧光素酶报告系统分析雄激素及其受体对Usp25基因ARE活性的调控作用。结果在S-Ar^-/y小鼠睾丸组织中矾p25基因表达量比在野生型小鼠中显著降低。在TM4细胞中睾酮可以显著提高Usp25基因表达量。在TM4细胞中，雄激素可以显著提高pGLP／Usp25的荧光素酶活性。结论Usp25基因表达可以被雄激素睾酮激活，Usp25基因第一内含子519至1102bp区域含有ARE，可以调控启动子的转录水平。

线粒体蛋白酶LONP1在前列腺癌生物学行为中的作用机制研究

目的:探讨线粒体离子肽酶1(lon peptidase 1,mitochondrial,LONP1)在去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)进展中的作用机制。方法:采用蛋白质印迹法检测前列腺增生细胞BPH-1、雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCa P和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(即CRPC细胞)PC3中LONP1、N-myc下游调节基因1(N-Myc downstream-regulated gene 1,NDRG1)和雄激素受体(androgen receptor,AR)蛋白的表达水平。采用慢病毒感染的方法将携带有LONP1全基因的重组载体转入LNCa P细胞,构建稳定过表达LONP1(overexpression LONP1,OE-LONP1)的LNCa P细胞(以OE-NC作为阴性对照);将特异性针对LONP1基因的sh RNA(sh LONP1)转入PC3细胞,构建稳定沉默LONP1表达的PC3细胞(sh NC作为阴性对照);分别通过CCK-8法、集落形成实验和Transwell小室侵袭实验检测细胞的增殖和侵袭能力。通过免疫共沉淀和染色质免疫沉淀法检测LONP1对AR/NDRG1信号轴的影响,并采用CCK-8法和Transwell小室实验检测在沉默LONP1表达的PC3细胞中进一步沉默NDRG1表达对PC3细胞增殖及侵袭能力的影响。将沉默LONP1表达的PC3细胞及其阴性对照(PC3-sh NC细胞)接种于BALB/c裸鼠皮下构建移植瘤模型,并分别采用DMSO和AR拮抗剂恩杂鲁胺(enzalutamide,ENZ)进行治疗;最后,分别采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中Ki-67的表达水平,TUNEL法评估肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡情况。结果:相较于前列腺增生细胞BPH-1细胞,LNCa P细胞中LONP1的蛋白表达水平相对较低(P<0.05),PC3细胞中LONP1蛋白的表达水平相对较高(P<0.05)。LNCa P细胞中LONP1过表达抑制了AR和NDRG1的表达水平(P均<0.05),而PC3细胞中下调LONP1的表达水平可上调AR和NDRG1的表达水平(P均<0.05)。LNCa P细胞中LONP1过表达促进了细胞的增殖和侵袭能力(P均<0.05),PC3细胞中敲低LONP1表达抑制了细胞的增殖和侵袭能力(P均<0.05)。LONP1直接与AR结合并识别NDRG1中的雄激素反应元件(androgen response element,ARE),并且其通过抑制AR/NDRG1信号通路促进前列腺癌的进展。小鼠移植瘤治疗实验结果显示,沉默LONP1表达和ENZ治疗都可以抑制肿瘤的生长,以沉默LONP1表达联合ENZ治疗作用最好;免疫组织化学法和TUNEL法检测结果提示,sh LONP1+ENZ组肿瘤组织中表现出更低水平的Ki-67染色和更高水平的细胞凋亡(P均<0.001)。结论:LONP1在雄激素非依赖性细胞PC3中高表达,并通过抑制AR/NDRG1信号转导促进前列腺癌的进展。