稀有鮈鲫雄激素受体基因的克隆和内分泌干扰物对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE法分离了稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）精巢雄激素受体基因（AR）的cDNA,其核苷酸序列3 130 bp,编码844个氨基酸。它的氨基酸序列与鲤科鱼类AR的同源性较高。AR基因在稀有鮈鲫的性腺、肝、脑、肠和肌肉等组织中均有表达,在雄性个体中精巢和肝脏的表达量最高,其他组织较低,而在雌性个体除肌肉中表达量较低外,其他组织均为中等水平的表达。0.01和0.1 nmol/L的乙炔基雌二醇暴露3 d后,能够分别非显著和显著地提高稀有鮈鲫幼鱼AR的mRNA表达,而1 nmol/L的乙炔基雌二醇则对其表达有下调的趋势,0.1~10 nmol/L的双酚A对其表达均有显著下调,0.01μmol/L壬基酚对其表达有显著下调,而0.1和1μmol/L壬基酚对其表达均有下调的趋势,因此不同种类内分泌干扰物及其不同暴露浓度对稀有鮈鲫AR的mRNA表达有不同影响。

核受体活性筛选在内分泌干扰物检测中的应用

内分泌干扰物是备受国内外关注的一类污染物,其种类繁多、分布范围广,在各类介质如水体、土壤、大气、生物体乃至人体中均有检出,对生态环境和人类健康具有潜在威胁。核受体途径是内分泌干扰物发挥作用的重要机制之一,一些内分泌干扰物可通过核受体介导途径调节靶基因的转录,从而产生内分泌干扰活性。常见的核受体响应的生物筛选方法采用离体细胞或无细胞测试,具有操作简便、速度快的特点。这些方法可用于化学纯品的内分泌干扰活性筛查,也可应用于实际复杂介质中内分泌干扰物的识别。该文综述了国内外内分泌干扰物筛选的标准方法及现状、基于核受体响应的内分泌干扰活性筛选方法以及核受体活性筛选在不同复杂介质内分泌干扰物检测中的应用,并对基于核受体活性筛选的内分泌干扰物检测的未来研究重点以及我国内分泌干扰物筛选方法的建立进行了展望,以期为我国新污染物筛查提供数据和技术参考。

环境化学物雄激素干扰活性检测方法的建立

目的:建立雄激素受体(AR)介导的荧光素酶(Luc)报告基因试验方法,为化学物拟/抗雄激素活性的检测提供研究工具。方法:构建受雄激素反应元件调控的荧光素酶报告基因质粒pMMTV-Luc,将该质粒与表达AR的质粒AR/pcDNA3.1和阳性对照质粒phRL-tk共转染CV-1细胞,建立AR报告基因试验。以5α-双氢睾酮(5α-DHT)为阳性对照检测该方法的筛选效率。CV-1转染后用受试化学物染毒,根据Luc表达的变化,判断化学物的雄激素干扰活性。结果:5α-DHT对共转染三种质粒的CV-1的诱导作用表现为:10-10M的5α-DHT显著诱导Luc的表达,10-7M时达最大值,诱导倍数为61.83倍,计算其半数效应浓度EC50为3.65 nM。糖皮质激素受体(GR)激动剂地塞米松(dexamethasone)不诱导Luc的表达。AR拮抗剂氟他胺(flutamide)在10-7M～10-5M浓度范围内显著拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达,其半数抑制浓度(IC50)为3.49μM。BPA在10-6M和10-5M时能拮抗1 nM 5α-DHT诱导的Luc的表达,其IC50为2.14μM。结论:本研究建立的AR报告基因试验具有较高的灵敏度和特异性,化学物BPA具有抗雄激素活性。

HQSAR预测内分泌干扰物的雄激素活性

环境中的内分泌干扰物（Endocrine disrupting chemicfls，EDCs）如雄激素类物质，能够干扰人类和野生动物的内分泌功能，影响体内激素的合成、分泌、作用和代谢等各个环节，从而对个体的生殖、发育等产生多方面的影响，并引起种种负面生物学效应。

密蒙花提取物滴眼剂对实验性干眼症大鼠泪腺组织雄激素受体数量的影响

目的观察密蒙花提取物滴眼剂对去势所致干眼症雄鼠基础泪液分泌量、泪膜稳定性及泪腺中雄激素受体(AR)表达的影响,探讨密蒙花提取物滴眼剂抗雄激素水平下降所致干眼症的作用机制。方法将45只Wistar雄性大鼠随机分为空白组、模型组、密蒙花提取物滴眼剂治疗组(治疗组),每组又分为饲养1、2、3个月的3个亚组,共9组,每组5只,模型组及治疗组行去势术建立动物模型,治疗组以密蒙花提取物滴眼剂连续滴眼治疗1个月,对大鼠行Schirmer Ⅰ试验(SIT)、测量泪膜破裂时间(BUT),采用流式细胞仪检测泪腺中AR的表达。结果模型组1、2、3个月亚组SIT值、BUT及AR表达低于同期空白组(P<0.01);治疗组与模型组间比较以3个月的亚组为例,给药后,治疗组SIT值(12.667±5.221)mm,明显高于模型组(2.676±1.987)mm;治疗组BUT(11.758±4.415)s,明显长于模型组(4.667±2.108)s;治疗组AR阳性表达率(49.33±3.44)%,明显高于模型组(33.32±7.12)%(P<0.01)。结论密蒙花提取物滴眼剂中主要成分为黄酮类物质,可显著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼症的发生,其作用机制可能与黄酮类物质结构与雄激素类似相关。

密蒙花提取物滴眼对干眼症去势鼠泪腺组织雄激素受体数量的影响(英文)

目的:观察密蒙花提取物滴眼剂对去势所致干眼症雄鼠基础泪液分泌量、泪膜稳定性、泪腺中雄激素受体表达的影响,探讨密蒙花提取物滴眼剂抗雄激素水平下降所致干眼症的作用机制。方法:将45只Wister雄性大鼠随机分为空白组(A1、A2、A3)、模型组(B1、B2、B3)、密蒙花提取物滴眼剂治疗组(C1、C2、C3),共9组,1代表饲养1mo,2代表饲养2mo,3代表饲养3mo,每组5只,对B、C组行去势术建立动物模型,对C组以密蒙花提取物滴眼剂连续滴眼治疗1mo,对全部实验大鼠行Schirmer I试验、测量泪膜破裂时间,采用流式细胞仪检测泪腺中雄激素受体的表达。结果:C组Schirmer I试验测量值明显高于B组(P<0.01),泪膜破裂时间明显长于B组(P<0.01),显示密蒙花提取物滴眼剂能够显著维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性;C组流式细胞仪检测的AR阳性表达率明显高于B组,显示密蒙花提取物滴眼剂中的有效成分可能有拟雄激素的效应。结论:密蒙花提取物滴眼剂中主要成分为黄酮类物质,可显著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼症的发生,其作用机制可能与黄酮类物质结构与雄激素类似,可以起到拟雄激素效应,从而维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性。

松花江水内分泌干扰物及雌激素活性调查

为明确松花江水体中内分泌干扰物的污染状况,利用固相萃取富集-气质联机/重组基因酵母对松花江全江11个典型断面进行全面采样分析.结果表明:江水中∑5ES质量浓度在6.59～30.97 ng/L,平均值为17.23 ng/L,出现最大质量浓度的位置是达连河排污口,雌酮(E1)和雌二醇(E2)是其中贡献最大雌激素,其质量浓度范围为1.54～6.34和1.86～20.78 ng/L,主要来源于城市污水;所有采样点均检出了壬基酚(NP)、辛基酚(OP)和双酚A(BPA),其质量浓度范围分别为236.3～1067.9、3.07～256.10和13.0～206.5 ng/L,均值为512.8、34.1和52.8 ng/L,其质量浓度均高于雌激素,主要来源于生活污水和工业废水;松花江水体的雌激素活性为0.50～26.16 ng/L,最大值出现在哈下采样点,生活污水是雌激素活性的一个重要来源,其他采样点EEQ质量浓度均小于3.60 ng/L,其质量浓度与国内外河流处于同一污染水平,但存在潜在的生态安全问题.

改进型重组基因酵母TR-GRIP1检测化合物甲状腺激素干扰活性

应用酵母双杂交技术构建重组TR(甲状腺激素受体)基因酵母,用以检测类抗甲状腺激素化合物及环境样品的甲状腺激素干扰活性.提取并纯化含有TR基因的酵母表达质粒pGBT9-TR以及含有TR共激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒pGAD424-GRIP1,将pGBT9-TR和pGAD424-GRIP1同时转化至酵母细胞Y187,以营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)筛选阳性菌落,构建TR-GRIP1双杂交酵母.考察该酵母与天然甲状腺激素——T3(三碘甲状腺原氨酸)的结合情况,确定最佳暴露时间,建立剂量-效应关系曲线.结果表明:TR-GRIP1双杂交酵母能够与T3结合诱导β-半乳糖苷酶活性,选择暴露时间为2 h,T3诱导酶活性的EC50值为1.1×10-7 mol/L;构建的重组基因酵母TR-GRIP1提供了检测化合物甲状腺激素干扰活性的新方法.

干扰素诱导蛋白P56与糖皮质激素受体的相互作用及对其转录活性的影响

糖皮质激素受体(GR)在严重创伤早期及全身性炎症反应中具有重要作用,为寻找与GR相互作用的新的蛋白质,以期调节GR的功能活性,应用酵母双杂交技术,以糖皮质激素受体配体结合区(GR LBD)为诱饵蛋白,在人骨髓cDNA文库中筛选到 4 2个阳性克隆.测序结果表明,其中一个克隆为干扰素诱导蛋白P5 6的大部分编码序列(2 2 1～ 16 4 2bp,编码第 5 3位至第 4 78位氨基酸).利用酵母双杂交实验再次验证P5 6与GR具有结合作用.并用PCR方法从酵母质粒中扩增出P5 6片段,进行GST P5 6原核融合蛋白表达与纯化,及真核表达与免疫共沉淀.蛋白质结合实验表明,P5 6与GR LBD在体内外有结合作用.CAT报告基因检测表明P5

RNA干扰沉默雄激素受体基因对前列腺癌细胞生长的抑制作用研究

目的设计、合成针对雄激素受体(AR)基因的具有高干扰效率的si RNA,观察其对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法设计、合成多个针对AR的si RNA,转染前列腺癌细胞LNCaP,筛选出对AR基因干扰效率最高的ARsi RNA,用RT-PCR检测AR mRNA水平,并计算细胞生长抑制率。结果采用Silencer si RNA Construction Kit成功合成了ARsi RNA,转染LN-CaP细胞,筛选出一个对其生长抑制作用最强的si RNA,并证实AR mRNA水平显著下降,LNCaP细胞的生长抑制率为78.2%。结论针对雄激素受体的si RNA可沉默雄激素受体基因,并抑制前列腺癌细胞的生长。

双酚A类似物雌激素干扰效应的定量结构-活性关系模型

由于双酚A(BPA)具有内分泌干扰等毒性效应,有些国家已经开始限制其在部分工业品生产中使用。一些双酚A类似物因用于替代BPA而被大量使用。因其与双酚A具有相似的分子结构,双酚A类似物是否也具有内分泌干扰等毒性效应受到越来越多的关注。采用逐步多元线性回归(MLR)方法,构建了可预测双酚A类似物雌激素效应的定量结构-活性关系模型。模型的决定系数R^2=0.899,去一法交叉验证系数Q_(LOO)~2=0.868,Bootstrapping验证系数Q_(BOOT)~2=0.755,均方根误差RMSE=0.339,表明模型具有较好的拟合优度、稳健性;验证集决定系数Q_(EXT)~2=0.921,外部验证系数Q_(EXT)~2=0.810,均方根误差RMSE=0.638,表明模型具有较好的预测能力。采用欧几里德距离方法和Wil iams图表征了模型应用域,依据分子描述符对模型进行了机理解释,并用所建模型,填补了22种其他双酚A类似物缺失的雌激素干扰效应数据。

雄激素受体RNA干扰质粒的构建及其对毛乳头细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的:构建雄激素受体(androgen receptor,AR)RNA干扰的真核表达质粒,并将其转染人毛乳头细胞(dermal papillacell,DPC)后观测其对AR表达的影响。方法:应用基因重组技术构建AR的RNA干扰质粒,经测序鉴定后以脂质体转染方法将质粒转染DPC,Western blot检测被转染细胞AR蛋白的表达。结果:成功构建了雄激素受体RNA干扰的真核表达质粒,将其转染了人DPC后,经Western blot证实AR RNA干扰质粒能使DPC细胞AR蛋白含量显著下降(P<0.05)。结论:AR的RNA干扰质粒能抑制DPC内AR的表达,该实验为雄激素性脱发基因治疗的实验研究提供了必要的基础。

滋肾阴泻相火中药对环境内分泌干扰物染毒大鼠生殖器官雌激素受体表达的影响

目的观察滋肾阴泻相火中药对壬基酚及双酚A染毒大鼠子宫、卵巢雌激素受体(ER)基因和蛋白表达的影响,探讨该中药拮抗环境内分泌干扰物(EEDs)拟雌激素活性的作用机制。方法3周龄雌性SD大鼠染毒组单纯喂饲壬基酚或壬基酚与双酚A联合喂饲,治疗组以滋肾阴泻相火中药与染毒物同时喂饲,对照组喂饲溶剂玉米油,给药15天,分别检测子宫湿重及脏器系数、子宫及卵巢ER基因和蛋白表达水平。结果染毒组与对照组比较,子宫湿重及子宫系数增加,ER蛋白表达显著上调;卵巢ERα、ERβ的基因表达及蛋白水平显著上调(P<0.05)。治疗组与染毒组比较,子宫湿重、子宫系数降低,ER的蛋白表达显著下调;卵巢ERα、ERβ的基因表达及蛋白水平显著下调(P<0.05)。结论EEDs对生殖器官有显著的拟雌激素作用,而滋肾阴泻相火中药对EEDs的拟雌激素活性具有显著的拮抗作用。中药的治疗干预可使生殖器官ER基因、蛋白表达显著下调,从而显著降低生殖器官对EEDs的敏感性,这可能是所用中药有效拮抗EEDs拟雌激素活性的主要作用机制之一。

运动时骨骼肌雄激素受体表达和活性改变及其对运动能力的影响

机体运动能力与雄激素水平呈较高的正相关。雄激素通过与雄激素体受体(AR)结合发挥其促进骨骼生长、肌肉肥大和刺激促红细胞生成素分泌的作用。本文综述了耐力运动、抗阻运动对骨骼肌AR表达水平和转录激活活性的影响,即适度的耐力和抗阻运动均会增加骨骼肌等组织AR的蛋白表达、结合容量和转录激活活性,而过度运动或力竭运动会降低骨骼肌AR的蛋白水平、结合容量和转录激活活性,并进一步从睾酮的作用(睾酮增加AR的mRNA水平、延长AR的半衰期)、胰岛素生长因子-1信号通路(IGF-1通过MAPK通路,包括p38,ERK1/2和JNK,以及通过PI3K/Akt-Foxo1通路来实现其增加AR蛋白表达和促进核转位的作用)和胰岛素生长因子-1受体信号通路(IGF-1R通过PI3K激活AR的转录激活活性)来阐述运动对骨骼肌AR表达水平和转录激活活性影响的机制。本文还综述了AR表达水平对运动能力的影响,但这方面相关的研究还比较少,仍有许多问题有待解决。

水中痕量污染物雌激素的内分泌干扰活性评价

雌激素近年来已成为水中的常见痕量污染物之一,该文对水中常见的雌激素种类、主要来源、物化性质、内分泌活性评价等进行了较为详尽的论述,对雌激素污染可能带来的问题进行了介绍。研究表明,重视水中雌激素污染问题,并寻求合理的解决办法,是当前给排水处理工作者的主要任务之一。

雄激素与心血管活性物质的相互作用

雄激素对心房利钠肽、内皮素、儿茶酚胺、降钙素基因相关肽及TXA_2/PGH_2受体、局部肾素—血管紧张素系统有明显的调节作用,同时心房利钠肽、降钙素基因相关肽又影响睾丸间质细胞的睾酮产生,他们之间的相互作用在心血管疾病的性别差异中起一定作用。

内分泌干扰物对雌激素受体信号通路的影响

内分泌干扰物(endocrine disruptive chemicals,EDCs)可通过干扰雌激素受体(ER)信号通路影响相关转录活动.在阐述ERα和β两个亚型的基本结构特征和其信号转导途径的基础上,重点回顾近年来关于EDCs对ER信号转导通路干扰机制的研究进展.EDCs对ER信号通路的干扰机制包括配体依赖和非依赖两种,配体依赖机制分为直接作用和间接作用.直接作用的机制是EDCs可作为配体与雌激素竞争ER上的结合位点,从而影响ER的促转录活性.间接作用机制的研究热点集中在芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR),EDCs作为配体可激活AhR,而AhR能够促进ER蛋白泛素化并降解,也可通过与ER竞争辅助激活因子或直接影响ER介导的DNA转录.EDCs通过非配体依赖以及非基因组途径干扰机体的内分泌活动的机制目前仍不清楚,提示未来需注重研究EDCs对多种信号通路的影响.

中药对环境内分泌干扰物的拟雌激素活性拮抗作用

目的:采用中药对环境内分泌干扰物(EEDs)暴露水平较高的性早熟患儿进行治疗干预,验证所用中药方案对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用。方法:制定针对EEDs拟雌激素活性的中药治疗方案。以该中药制剂治疗73例EEDs暴露水平较高的性早熟女孩,疗程3个月。治疗前后分别测定子宫、卵巢体积、血清雌二醇(E2)、骨矿含量、骨密度及血清骨钙素(OST)含量。并以该中药制剂治疗壬基酚(4-NP)及双酚A(BPA)的染毒动物模型,疗程为14d。治疗前后分别测定其子宫湿重、子宫内膜上皮高度、子宫平滑肌厚度、子宫内膜上皮细胞增殖核抗原(PCNA)的蛋白表达水平及股骨的骨密度。所有指标均进行治疗前后的对比分析,数据处理采用SPSS11.5统计分析软件。结果:治疗后性早熟患儿的子宫体积、血清E2含量及骨矿含量、骨密度、血清OST含量均明显下降(P<0.01);4-NP及BPA染毒动物的子宫湿重、子宫内膜上皮高度、子宫平滑肌厚度、PCNA的蛋白表达水平及股骨骨密度均显著下降(P<0.05)。结论:所制定的中药治疗方案对EEDs的拟雌激素活性具有显著的拮抗作用。