集群分离分析法在作物分子标记研究中的应用及问题分析

分子标记的获取有助于辅助选择育种和基因的图位克隆。集群分离分析法是快速有效地寻找与目的基因紧密连锁分子标记的经典方法,广泛应用于作物育种中。其原理简单、方便经济,与近等基因系分析法相比具有一些特有的优势。本文介绍了集群分离分析法的基本理论,并从几个方面分析了其应用过程中要注意的问题:包括物种基因组大小的影响、非目的标记的产生、以及如何构建DNA池等。同时概述了集群分离分析法在F2代、回交、双单倍体、重组自交系等不同分离群体中的应用情况,并对不同分离群体的优缺点进行了比较。最后描述了集群分离分析法对池内基因信息进行定量分析的应用前景。总之,我们期望通过本文为集群分离分析法的合理使用提供一定的参考。

利用超级集群分离分析法鉴别大豆增变基因

【目的】利用大豆基因组Wm82.a2.v1及HapMap数据来鉴别大豆中可能存在的增变基因。【方法】将大豆HapMap数据（包含19 652份大豆种质在52 041个位点上的分型结果）预处理后,利用改进的超级集群分离分析法,选取滑动窗口大小、步长及阈值大小为参数,对预处理后的大豆种质数据进行分析,测算大豆点突变比率及突变热点区数目,并将点突变比率及突变热点区数目与分子标记进行关联性分析,从强关联区内挖掘候选增变基因,用大豆基因组Wm82.a2.v1对其功能进行初步推测。【结果】大豆HapMap数据预处理后,15 391份大豆种质点突变比率为0.089~0.531,平均变异率为0.261;突变热点区数目为5~1 324个,平均每份种质包含347.8个突变热点区。超级集群分离分析结果表明,Gm16上的29 153 474-30 604 603bp和Gm17上的12 133 293-12 147 725bp片段为与点突变比率和突变热点区数目2个表型同时存在强关联的区域;其中Gm16上的Glyma16g26440.1和Gm17上的Glyma17g15420.1同属于nudix水解酶基因家族,推测其与基因组突变有关。【结论】Glyma16g26440.1和Glyma17g15420.1 2个nudix水解酶基因家族成员都与点突变比率和突变热点区数目存在强关联,可作为大豆基因组候选增变基因。

小麦种质资源茎基腐病抗性鉴定及定位分析

采用小米培养基接种法对163份当前推广的小麦种质资源进行室内和田间茎基腐病抗性鉴定。结果表明,没有鉴定出高抗和免疫的小麦材料,但是不同材料的抗性能被明显区分,群体抗性整体上呈现正态分布趋势,室内鉴定病情指数分布在13.28~83.33之间,田间鉴定病情指数分布在10.27~73.89之间。室内和田间鉴定结果较稳定,两环境病情指数的相关系数为0.79,说明室内鉴定结果可较好反映田间抗性情况。全基因组关联分析(GWAS,genome-wide association study)显示,显著SNP广泛分布于小麦各条染色体上,其中2A上最多,集中在725~763 Mb区段内。进一步集群分离分析法(BSA,bulked segregant analysis)结果显示,显著SNP集中在2A上的730~750 Mb区段内。综合来看,小麦2A染色体上730~750 Mb区段内可能存在显著调控小麦茎基腐病的抗性基因。本研究能够为小麦茎基腐病抗性材料筛选及抗病位点挖掘提供重要的参考意义。

集群分离分析法在植物基因定位上的应用

集群分离分析法是一种检测位于特定染色体区段上的标记方法,常被应用针对植物极端性状进行功能基因挖掘。近年来随着测序技术的提高和测序成本的降低,BSA技术在植物基因定位中的应用越来越广泛,并显示了巨大的应用潜力。本研究就BSA技术特点以及在不同作物上的应用研究,特别是基于测序的BSA方法在基因定位上最新进展情况进行汇总和概述。

基于二代测序的集群分离分析法在木本植物基因定位中的应用

植物重要性状相关的数量性状基因座(QTL)和基因定位一直是结构基因组学的研究重点,也是遗传机制解析和分子育种的重要基础。木本植物具有重要的经济、生态价值,但用于其研究的传统基因定位方法存在耗时长、工作量大、通量低、成本高且效果不佳等问题。近年来,由于测序技术发展日新月异,基于二代测序技术的集群分离分析法(NGS-based BSA)开始应用于木本植物中。与传统的集群分离分析法(BSA)技术相比,NGS-based BSA周期短、效率高,能对质量或数量性状进行精确定位,在木本植物遗传学和组学研究方面具有广阔的应用前景。文中简述了BSA的发展历程和研究策略,综述了其在木本植物研究中的进展,分析了NGS-based BSA的优势及存在的问题,展望了其在木本植物遗传学、组学和种质改良领域中的应用潜力。

利用KASP标记定位小麦群体中的无芒位点Awn-4A.1

芒是小麦穗部重要的光合器官之一,是小麦长期进化和适应环境的产物,对小麦产量和逆境适应具有重要影响。为了探究芒的发育及芒长的遗传机制,本研究利用小麦无芒品种中国春(Chinese Spring,CS)和有芒品系MK147构建的F2分离群体与F5代重组自交系(RIL)群体为材料,对无芒位点进行了标记和定位。遗传分析表明,群体中的无芒性状受半显性单基因控制;采用Wheat660K SNP芯片结合集群分离分析法(bulked segregate analysis,BSA)在F2群体构建的无芒、有芒混池中检测到一个多态性SNP标记的富集区,初步将QTL定位于4A染色体上。在该QTL区间开发了58个KASP标记,并将定位区间缩小至KASP标记SNP-1537与SNP-4195之间,遗传距离为0.81 cM,对应中国春参考基因组(IWGSC.Ref.V1.0)4A染色体上9.23 Mb(100.56〜109.79 Mb)的区间,将该位点命名为Awn-4A.1。

油菜单显性核不育及其不育基因的RAPD标记

以陕西省杂交油菜研究中心选育的单显性核不育油菜分离群体为材料,对单显性核不育油菜的育性特征、花器形态进行了多代跟踪调查;对其遗传规律进行了探讨,确定该不育性状受一对显性核基因控制;利用集群分离法 BSA 对该油菜单显性核不育基因进行了RAPD分析.在所选用的300个随机引物中,获得引物S243 5'CTATGCCGAC3' 在可育集团与不育集团间扩增出多态性产物S-2431500.通过对该分离群体及其姐妹系分离群体进行单株验证,均获得相同的扩增结果,表明S-2431500与单显性核不育基因相连锁,

油菜单显性核雄性不育基因的分子标记

以陕西省杂交油菜研究中心选育的单显性核不育油菜分离群体为材料,利用集群分离法(BSA)对该油菜单显性核不育基因进行了RAPD分析。在随机选取的300个10碱基随机引物中,引物S243(5'CTATGCCGAC3')在可育集团与不育集团间扩增出特异而可重复的1.5kb的多态性片段OPU-031500,而在细胞质雄性不育和其它核不育类型油菜中均未扩增出上述特异性片段,从而确证此RAPD标记OPU-031500片段是与甘蓝型油菜单显性核不育基因连锁的。将该多态性片段克隆并测序,发现其序列与拟南芥的一段DNA序列高度同源。根据同源序列及测序结果设计两对特异引物(P1/P2和P3/P4),引物P3/P4在可育系中可扩增到约1.5kb的单一特异片断,而在不育系中无带,从而将RAPD标记转化为稳定可靠的SCAR标记。

大豆细胞质雄性不育育性恢复基因Rf3的定位

在植物细胞质雄性不育/恢复系统中,一个不育基因能够被不同的恢复基因所恢复。在利用"三系"法进行杂交大豆选育过程中同样发现,作为父本的恢复系恢复能力不尽相同,可能存在不同的育性恢复基因。本研究以大豆细胞质雄性不育系JLCMS84A为母本,以恢复系JLR1为父本配制杂交组合,以所获得的F2分离群体为试验材料,在大豆盛花期(R2期)根据花粉育性鉴定及显著性分析结果,明确JLR1所含恢复基因为显性单基因配子体遗传模式;结合集群分离分析法(BSA,bulked segregant analysis)和高通量测序技术,将其定位在第9号染色体上;进一步利用简单重复序列(SSR,simple sequence repeat)分子标记将该基因定位在分子标记BARCSOYSSR_09_1151和BARCSOYSSR_09_1183之间,遗传距离分别为0.6cM和0.5 cM,研究结果表明该基因是一个不同于已有研究的新恢复基因位点,将其命名为Rf3。本研究为进一步进行Rf3基因的克隆及鉴定提供了研究基础,同时也为开发与该基因紧密连锁的分子标记,并利用分子标记辅助选择(MAS,markerassisted selection)含有此恢复基因的新恢复系提供了理论依据。

控制黄瓜白绿色果皮基因w的定位和候选基因预测

[目的]本文旨在通过对黄瓜白绿色果皮性状的研究,为果实性状相关的调控机制以及品种改良提供指导。[方法]以果皮颜色为白绿色的黄瓜自然突变体为材料,与野生型绿色果皮材料杂交、自交构建F2群体,在生理和遗传分析的基础上,利用集群分离分析法(BSA)结合重测序(BSA-seq)的方法来定位控制黄瓜白绿果皮的基因,并通过基因注释、RT-qPCR等方法来验证候选基因。[结果]色素含量分析表明,突变体果皮中叶绿素a和叶绿素b含量均显著低于绿色果实果皮中的含量。遗传分析表明,该白绿色果皮是由单基因控制的隐性性状。BSA-seq分析将候选基因定位于黄瓜3号染色体35.50～37.77 Mb和38.21～39.71 Mb。通过序列比对发现,在2个材料中有5个基因存在Indel的多态性。进一步通过基因表达分析显示,在果实的生长发育过程中,Csa3G904140基因在绿色果实中的表达水平明显高于白绿色果实。在白绿色突变体3号染色体Csa3G904140基因上1个单核苷酸插入造成终止密码子提前,导致101氨基酸残基的缺失。综合分析确定Csa3G904140是控制黄瓜白绿色果实颜色的候选基因。[结论]利用BSA和基因组重测序相结合的方法成功定位了控制黄瓜果实白绿色果皮的基因。

基于BSA分析定位控制西藏大麦侧小穗发育的基因

大麦侧小穗结实与否导致了二棱/六棱性状的分化,从而显著影响其籽粒产量,因此大麦二棱到六棱的变化具有显著驯化特征.青藏高原野生和栽培大麦资源丰富,被认为是栽培大麦的驯化和遗传多样性中心之一.为进一步了解大麦棱数调控的遗传基础以及西藏栽培大麦驯化的过程,以西藏野生二棱大麦和六棱大麦地方品种为亲本构建遗传分离群体,遗传分析发现二棱性状受单个显性基因位点控制.通过集群分离法(Bulked segregant analysis,BSA)分别建立含有22个F2单株的二棱混池和六棱混池,基于SLAF-seq(Specific-locus amplified fragment sequencing)技术共获得456 691个SLAF标签,通过SNP-index和ED两种关联算法交集得到3个与棱数性状相关的侯选区域,总长度为53.84M b,包含536个基因,其中能分别被3个数据库GO、K EGG和COG注释的基因有413、189和160个基因.上述研究实现了对控制西藏大麦侧小穗发育性状相关基因的初步定位,结果可为后续目标基因的精细定位和克隆提供理论参考.

水稻抗稻瘟病基因Pize(t)的定位与遗传分析

本研究前期在对205份水稻种质资源稻瘟病抗性鉴定中筛选到一份对稻瘟病达免疫级别的水稻品种"石梅抗",利用该抗原材料开展了两个方面的研究工作:(1)与现有栽培稻骨干亲本杂交后自交获得F2分离群体,通过病圃自然诱发抗性鉴定及表型筛选创造高抗稻瘟病种质资源。目前已经获得一百多份高抗稻瘟病、综合性状优异的中间材料并正在进行测配选育新的杂交稻组合;(2)利用集群分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)和隐性群体分析法(recessive-class analysis,RCA)对抗源稻瘟病抗性基因分析,最终将抗性基因定位在水稻6号染色体AP22和SRM24之间,对应日本晴基因组片段1 080 kb,并将该基因暂时命名为Pize(t)。

基于BSA的玉米花期相关性状基因定位

通过自交系R146与其早花期自然突变体ER146构建901个单株的F2群体,利用集群分离分析(BSA)中的欧氏距离(ED)算法与ΔSNP-index/ΔInDel-index算法,获得控制吐丝期性状基因的候选区间和位点,对候选基因进行功能注释。结果表明,通过ED值算法获得全基因组内最大的3号染色体上的ED关联区间,基于上述ED关联区间进一步通过ΔSNP-index/ΔInDel-index算法在此区间内检测出1个0.268 Mb的主效区间和19个微效位点。基因功能注释结果发现,主效区间内的1个基因和微效位点中的5个基因与玉米花期相关,此外还在主效区间发现了2个潜在的新基因。

甜高粱含糖量与出汁率的SRAP分子标记

甜高粱(Sorghum bicolor L.Beauv)作为重要的能源作物已经为大家所认可。本研究利用集群分离分析(BSA)法结合SRAP分子标记技术相结合,以141个甜高粱"W455"和粒用高粱"忻粱52"杂交形成的重组自交系F2:3群体为材料,寻找与甜高粱含糖量性状相关的SRAP分子标记。结果表明:含糖量遗传属于单基因加显或单基因加性效应模式,出汁率遗传是由多基因共同控制的数量性状;通过SRAP分子标记发现,在7号染色体上找到1个与含糖量基因连锁的SRAP标记M3E7-S248,通过测序比对发现其与高粱腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶亚基SH2有79%的相似度;在6号染色体上找到了3个与出汁率基因连锁的SRAP标记M8E2-J727(M8E2-J712)、M8R12-J241和F13E9-J150,其中M8E2-J712与M8E2-J727为共显性标记;通过测序比对发现标记M8E2-J712与多种植物叶绿体上的氧捕获增强蛋白高度一致;标记M8E2-J727与双色高粱未知功能蛋白m RNA中的一段序列具有99%的一致性;标记M8R12-J241和F13E9-J150均与6号染色体上的未知基因序列具有高度一致性。

甜瓜果实糖含量性状的遗传规律与基因定位

本实验以高糖自交系西州蜜(X25)和低糖自交系伽师瓜(JS)为亲本构建F2群体XJ F2,以高糖品种网纹甜瓜M157自交系和低糖自交系伽师瓜(JS)为亲本构建F2群体MJ F2。通过分析两个群体的果实糖度频率分布,发现两个群体的果实糖度均呈正态分布,符合数量性状遗传的典型特征。利用SSR标记通过集群分离分析法对糖含量性状相关的基因进行初步定位,发现XJ F2群体中具有3个SSR标记ECM134(LG4),MU3349(LG11)和CMAGN45(LG11)与甜瓜果实的糖含量性状连锁,并在MJ F2群体中发现两个SSR标记MU5035(LG10)和chr10-0380(LG10)与甜瓜果实的糖含量性状连锁。通过对已知甜瓜糖代谢相关酶基因在基因组中位点分析,发现与果实糖含量性状相关的位点与基因组中糖代谢酶基因存在共定位关系。本研究结果为后续对与果实糖含量性状相关基因的定位奠定了基础。

TOR介导的糖激活SAM活性的拟南芥自然变异位点鉴定

在黑暗条件下,糖能激活拟南芥的茎顶端分生组织(SAM)发育成叶状器官,该现象已成为植物糖敏感性的重要指标之一。本研究发现,通过RNAi降低雷帕霉素靶标(TOR)的表达,能降低拟南芥幼苗的糖敏感性,表明TOR参与了糖对SAM的激活。本研究还通过对265个拟南芥自然生态型的鉴定,筛选到了一个糖敏感性较低的生态型CS76205;进一步分析发现, Col-0和CS76205的F1代的糖敏感性处于Col-0和CS76205之间,偏向CS76205;Col-0×CS76205 F2群体的糖敏感性呈正态分布,通过二代测序对CS76205生态型和F2代的两个极端表型混合池进行全基因组重测序,在3号染色体定位到一个糖激活SAM活性相关的区域,位于2.520 Mb和3.715Mb之间,利用生物信息学的手段对该关联区域进行注释,筛选出9个关键的候选基因。这为进一步克隆该位点基因、揭示该基因功能及其和TOR之间的关系奠定基础。