人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达

背景:目前已有较多关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究,而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。目的:构建人雌激素β受体RNAi反转录病毒表达载体,并通过病毒介导其在人成骨样MG63细胞中表达。方法:根据GeneBank数据库提供的雌激素β受体基因核苷酸序列,选择设计3条针对人雌激素β受体干扰靶序列,并与pRNAT-H1.4/Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成反转录病毒。将包装好的反转录病毒,以空白及非特异性shRNA作为对照,感染人成骨样MG63细胞株。结果与结论:3个连接了雌激素β受体-shRNA的重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对雌激素β受体基因目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成反转录病毒。反转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。包装后的3种雌激素β受体-shRNA反转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制雌激素β受体的表达。其中以雌激素β受体-shRNA3为最佳的干扰序列。

补肾中药对雄性大鼠神经系统雌激素受体β的影响

目的通过检测服用补肾阳中药和补肾阴中药后的雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体(ERβ)mRNA及蛋白,从分子水平探讨补肾中药对雄性大鼠神经系统雌激素受体的影响。方法SD雄性大鼠,分为A、B、C3组,A、B分别给予补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子持续灌胃14d,C组作为空白对照,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测雌激素受体ERβmRNA表达量,免疫组化染色检测ERβ蛋白的分布及表达。结果A、B组杏仁核、皮质顶叶雌激素受体ERβmRNA表达量均显著高于C组(P<0.01,0.05),A组ERβmRNA表达量增高显著高于B组(P<0.01);A组和B组ERβ蛋白免疫组化阳性细胞均显著高于C组(P<0.01,0.05),A组皮质顶叶ERβ蛋白阳性细胞高于B组(P<0.01)。结论补肾中药对ERβ基因及蛋白具有调节作用。

雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响

背景:目前对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究较少。目的:研究雌激素受体β对人成骨样细胞骨保护素、核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。方法:将先前含有最有效干扰序列及非特异性shRNA的反转录病毒分别感染人成骨样MG63细胞株后,筛选稳定克隆并扩大培养,以空白及非特异性shRNA作为对照,检测稳定抑制雌激素受体β的效率。分别向3组细胞即MG63细胞、雌激素受体βshRNA反转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc反转录病毒感染的MG63细胞加入17β-雌二醇(E2)干预,检测人成骨样细胞株MG63的骨保护素、RANKL mRNA和蛋白表达情况。结果与结论:用pRNAT–H1.4/Retro-雌激素受体β-shRNA3进一步稳转人成骨样MG63细胞株,与空白及阴性病毒对照组相比,筛选出雌激素受体β表达稳定抑制的人成骨样细胞株,雌激素受体βmRNA抑制率为(88.17±1.17)%(P<0.05),蛋白抑制率为(89.01±1.22)%(P<0.05),证实实验成功建立了人成骨样细胞ERβ亚型基因敲低细胞模型。雌激素干预48 h后,显示雌激素受体β稳定抑制的MG63细胞较空白组及阴性对照组骨保护素mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),RANKL mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),骨保护素RANKL表达上调(P<0.05),提示雌激素受体β可能通过调节骨保护素/RANKL在骨代谢中发挥作用。

递增负荷运动及恢复过程中大鼠雌激素受体mRNA表达的变化及其意义

目的:观察持续9周递增负荷运动的不同训练周期及恢复过程大鼠HPO轴各环节ER mRNA水平的变化,探讨持续运动应激致动情周期紊乱ER水平变化的机制。方法:对不同训练周期及恢复过程的大鼠,采用RT-PCR检测下丘脑、垂体、卵巢、子宫各环节ER mRNA的表达,采用液相平衡竞争放射免疫分析法检测其血清雌二醇水平。结果:训练7周结束时,垂体及下丘脑ER mRNA表达及血清E2水平均显著降低,卵巢及子宫ER mRNA表达则显著增加;HPO轴各环节ER mRNA表达的变化持续至恢复2期,血清E2水平持续至恢复3期基本复原。结论:递增负荷运动大鼠HPO轴各环节ER mRNA表达对运动负荷的反应不尽相同,ER mRNA表达的变化与血清E2水平密切相关,其表达水平的非同一性可能是运动性月经失调病理过程的重要一环。

雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响

背景:雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少,其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。目的:分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。方法:实验分3组:空白对照组(即h FOB 1.19,未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-sh RNA-nc)、最佳RNAi组(即ERβ-sh RNA-3)。将前期最佳RNAi组的雌激素受体β-sh RNA反转录病毒载体感染人成骨细胞,通过抗性筛选并扩大培养,利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响;随后在雌激素干预下,通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率,并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。结果与结论:(1)成功筛选出稳定感染ERβ-shR NA-3反转录病毒载体的人成骨细胞,MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05);(2)在雌激素干预下,雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)%(P<0.05),且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mR NA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%,骨形态发生蛋白2 mR NA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)%(均P<0.05);(3)结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。

雌激素受体GPR30在大鼠下颌下腺组织中的定位、核心片段克隆及序列分析

目的探讨雌激素受体G蛋白耦联受体30(GPR30)在大鼠下颌下腺组织中的表达,为进一步研究此受体对下颌下腺的功能调节提供理论依据。方法取SD大鼠4只,腹腔麻醉后切取下颌下腺,采用免疫组织化学和原位杂交方法进行定位研究;从下颌下腺组织中分别提取总RNA,应用RT-PCR方法获得GPR30基因的cDNA核心序列,并进行序列分析。结果大鼠下颌下腺浆液性腺泡及颗粒曲管上皮细胞呈GPR30免疫反应阳性,阳性物质分布于细胞质和细胞膜上,细胞核呈阴性反应。上述细胞同样含有GPR30mRNA杂交信号,信号物质亦分布于细胞质内,细胞核呈阴性反应。经序列分析发现,从大鼠下颌下腺组织中扩增出GPR30基因的特异性条带。结论大鼠下颌下腺浆液性腺泡上皮细胞能够表达雌激素受体GPR30,说明其可能是雌激素快速作用的靶器官。

补肾中药对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体mRNA表达的影响

给雄性大鼠补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子,从分子水平探讨补肾中药对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶雌激素受体(estrogen receptor,ER)mRNA的调节表达差异,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测雌激素受体ERα和ERβmRNA表达量。结果:淫羊藿组、女贞子组大鼠杏仁核、皮质顶叶雌激素受体ERαmRNA表达量无明显变化,而淫羊藿组杏仁核、皮质顶叶雌激素受体ERβmRNA表达量高于女贞子组且均高于空白对照组(P<0.01),女贞子杏仁核ERβmRNA表达量高于空白对照组(P<0.05)。说明补肾中药可能对ERβ具有调节作用。实验结果与“对雌激素的调节补肾阴药物应优于补肾阳药物”的传统中药理论不一致,还需通过进一步的实验深入探讨。

LINE-1ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞的体外影响研究

目的探讨人反转座子长散在重复序列编码蛋白1(LINE-1 ORF-1p)对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响及可能机理。方法利用Lipofectin 2000将LINE-1 ORF-1的表达载体及其空载体,siRNA及其空载体转染进入ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1细胞。使用MTT法测定LINE-1 ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响;利用Luciferase检测LINE-1 ORF-1p对ERα转录活性的影响。结果 MTT法观察结果发现,LINE-1 Flag-ORF-1p能够显著促进ZR75-1细胞的生长(P=0.018)。LINE-1 ORF-1p siRNA表达载体能够抑制ZR75-1细胞的生长(P=0.022),其体外抑制率为E2-:25.51%,P=0.025,E2+:64.29%,P=0.021。LINE-1 Flag-ORF-1p能够升高ERα的转录活性(P=0.008)。LINE-1 ORF-1psiRNA表达载体能够降低ERα的转录活性(P=0.015),结论 LINE-1 ORF-1p能够通过升高ERα的转录活性,促进乳腺肿瘤细胞ZR75-1生长。

猪esr基因反转录转座子插入多态性及其与大白猪生产性能的关联性分析

雌激素受体(Estrogen receptor,esr)介导雌激素影响相关基因表达,从而调控哺乳动物的生长和繁殖机能。为了探讨esr基因的反转录转座子多态性对猪生长性能的影响,文中应用比较基因组学和生物信息学方法,预测猪esr基因的反转录转座子插入位点,采用PCR方法验证不同品种猪中插入多态性,并将该基因型与大白猪性能进行关联分析。结果显示,esr1和esr2基因验证后得到4个反转录转座子多态性位点,分别是位于esr1基因内含子2的esr1-SINE-RIP1、位于内含子5的esr1-LINE-RIP2和esr1-SINE-RIP3,以及位于esr2基因内含子1的esr2-LINE-RIP。其中esr1-SINE-RIP1的287 bp SINE插入对大白猪的活体背膘厚和100 kg体重背膘厚有显著影响(P<0.05),纯合有插入(SINE^(+/+))的活体背膘厚和100kg体重背膘厚显著高于杂合有插入(SINE^(+/-))和无插入(SINE^(-/-))型。这表明esr1-SINE-RIP1位点可作为分子标记辅助选育大白猪的背膘厚性状。

不同龄小鼠成骨细胞OPG和RANKL表达的变化

目的观察来源于不同龄小鼠成骨细胞经雌激素作用后,分泌骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子资B受体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand,RANKL)的变化。方法经雌激素作用前后,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)测定OPG、RANKL表达的变化。结果经雌激素作用后,幼年组和成年组OPG分泌显著增多,而老年组RANKL表达明显下调。结论雌激素可以刺激成骨细胞分泌OPG,减少RANKL表达,很可能是骨质疏松的发生机制之一,是绝经后骨质疏松发生的重要原因。