XW630对大鼠成骨细胞雌激素受体基因表达的影响

探讨抗骨质疏松新化合物 XW6 30促进成骨作用的机理。从 SD大鼠颅骨中分离培养成骨细胞 ,首次采用具有高灵敏度的逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术直接从大鼠成骨细胞中检测雌激素受体 m RNA的表达。结果表明 ,XW6 30具有促进成骨细胞 ERm RNA表达的作用 ,且呈时间依赖性。在相同浓度 (10 - 6 mol/ L)条件下 ,XW6 30作用强于四环素加哌嗪雌酮及单纯雌酚酮。XW6 30可能通过对

羟泰米酚对着床前小鼠子宫雌激素受体基因表达的调节作用

给怀孕第三天小鼠注射羟泰米粉，可使子宫雌激素受体基因（ＥＲｍＲＮＡ）表达明显改变，与给药前比较，６和１２小时组ＥＲｍＲＮＡ显著减少，与不同时间各自的对照组比较，这二个时间组的数值也显著降低；同时还观察到２４小时组ＥＲｍＲＮＡ明显增加，与以往分析雌激素受体（ＥＲ）蛋白水平的结果比较，可以看出ＥＲｍＲＮＡ与胞浆ＥＲ的动态变化具有一致性。

雌激素对D-半乳糖去卵巢小鼠及其apoE基因敲除鼠认知能力的影响

目的观察雌激素对D-半乳糖去卵巢C57BL/6 J小鼠及其apoE基因敲除鼠两组动物的认知能力的影响。方法采用D-半乳糖腹腔注射和双侧卵巢切除术制备D-半乳糖去卵巢动物模型(D-gal+OVX),1 w后补充雌激素组开始每周腹腔注射EB(EB)2次,6w后应用Morris水迷宫观察各组小鼠行为学改变。对apoE基因敲除鼠进行同样的处理。结果EB对模型组小鼠有改善认知功能的作用,而对apoE基因敲除组小鼠的认知功能没有改善作用。结论EB可能通过apoE依赖机制而发挥其改善认知功能的作用。

山楂对低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠脂代谢的影响

目的利用低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠作为高血脂动物模型,研究山楂对小鼠脂代谢的影响,并探讨其可能的作用机制。方法将LDLR-/-小鼠随机分为正常对照组和山楂干预组(n=10只/组)。饮食干预20周后取血并解剖。采用氯仿(V)︰甲醇(V)(2︰1)混合液抽提肝脏总脂质,酶法分别测定甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。利用快速蛋白层析(FPLC)法分离血清脂蛋白,酶法测定各馏分中TG和TC含量。Real-time检测HMG-CoAR、FAS、PPARα、SREBP-1c脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果山楂干预组小鼠血清中TG和TC含量,肝脏总脂质、肝脏中TG和TC含量均低于对照组(P<0.05)。与对照组比较,山楂干预组血清中的极低密度脂蛋白甘油三酯(VLDL-TG)、胆固醇(VLDL-C)和低密度脂蛋白/中密度脂蛋白甘油三酯(LDL/IDL-TG)、胆固醇(LDL/IDL-C)明显降低。山楂干预组的脂代谢相关基因mRNA表达水平与对照组相比均有统计学差异。结论山楂能调节脂质代谢,具有明显的降血脂作用。

肝X受体激动剂对ApoE基因敲除小鼠主动脉壁C-反应蛋白和CD40配体表达及平滑肌细胞含量的影响

目的探讨肝X受体(liver X receptor,LXR)激动剂T0901317对高脂饲养ApoE基因敲除(apolipoprotein E gene knockout,ApoE-/-)小鼠在动脉粥样硬化病变形成的早期动脉壁内C-反应蛋白(CRP)和CD40配体(CD40L)表达及平滑肌细胞含量的影响。方法8周龄雄性ApoE-/-小鼠12只,按随机数字表法分入LXR激动剂T0901317组和二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,每组6只。均给予高脂饲养8周,在高脂饲养的后4周,分别给予LXR激动剂T090131720mg·kg-1·d-1或相当剂量的DMSO腹腔注射。麻醉处死小鼠后,取小鼠主动脉,以石蜡包埋,行主动脉根部连续切片,采用免疫组化法检测主动脉壁内CRP、CD40L和平滑肌细胞α-actin的表达,以Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。结果LXR激动剂组动脉壁CRP表达水平较对照组明显减少(P<0.05),LXR激动剂组动脉壁CD40L表达水平较对照组明显减少(P<0.05),动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞α-actin表达水平与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。结论LXR激动剂可能通过抑制ApoE-/-小鼠动脉壁中CRP和CD40L的表达,减轻血管壁的炎症反应,从而发挥抗动脉粥样硬化形成的作用。

多巴胺D_3受体基因敲除对小鼠基础痛阈的调制作用

目的研究多巴胺D3受体对小鼠基础痛阈的调制作用,为进一步探讨D3受体在痛觉调制作用中的分子机制奠定基础。方法对实验小鼠进行适应性预处理后,用甩尾仪测定D3受体基因敲除小鼠(D3-/-)及具有相同遗传背景的野生型(C57BL/6J)小鼠的基础痛阈。结果D3受体基因敲除小鼠的基础痛阈高于野生型C57BL/6J小鼠,统计学检验显示两组间有显著性差异(P<0.05)。结论多巴胺D3受体可能参与痛觉的调制过程,对脊髓伤害性反射具有紧张性下调易化效应。对进一步在分子水平探讨多巴胺对痛觉调制作用机制奠定了基础。

雌激素受体α真核表达载体的构建及在大鼠骨髓基质干细胞中的表达

目的雌激素在很多靶器官中发挥重要生物调节作用,主要通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)来介导。构建ERα真核表达载体并于大鼠骨髓基质干细胞(rat marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中表达,为后续研究ERα的功能奠定良好的基础。方法采用RT-PCR技术从SD大鼠子宫及双侧附件中提取并扩增ERα,酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+);重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染rBMSCs,采用RT-PCR和Western blotting分析ERα在细胞中的表达,并采用Realtime-PCR和MTT的方法比较ERα高表达后对细胞生长周期的影响。结果成功构建了重组质粒pcDNA-ERα,RT-PCR和Western blotting显示该质粒能在rBMSCs中高效表达,Realtime-PCR和MTT比较分析表明,ERα的高表达对细胞的生长产生一定的抑制作用。结论成功构建ERα真核表达载体,该载体在rBMSCs中成功转录与表达,外源性ERα基因转染能使rBMSCs的增殖受抑,可能与ERα的核内高表达相关。

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中血小板因子4和Toll样受体2的表达

目的观察高脂饲养的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块表达Toll样受体2和血小板因子4的情况,探讨血小板因子4对内皮细胞Toll样受体2表达的影响。方法高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除小鼠12周,建立动脉粥样硬化模型。安乐死处死动物,原位灌流固定,取主动脉于10%中性缓冲福尔马林中固定,石蜡包埋连续切片,HE染色观察动脉粥样硬化斑块形态,免疫组织化学检测斑块中Toll样受体2和血小板因子4的表达。结果载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂水平明显增高,主动脉HE染色可见态动脉粥样硬化病变。在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉富含脂质斑块中Toll样受体2表达上调,其中血管内皮细胞、巨噬细胞表达Toll样受体2明显增多。载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块中也发现有血小板因子4表达,主要在内皮细胞和动脉粥样硬化斑块肩部。结论1.载脂蛋白E基因敲除小鼠粥样斑块中Toll样受体2表达上调,并且Toll样受体2主要表达在粥样斑块的内皮细胞和巨噬细胞上。2.载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中可见血小板因子4表达。

炎症对SRA/CD36双基因敲除小鼠肝LDL受体表达的影响

目的探讨炎症对清道夫受体A（scavenger receptor A，SRA）和CD36双基因敲除（SRA-／-/CD36-/-）小鼠肝脏LDL受体表达的影响及其潜存机制。方法将1～3月龄，体质量为18～23g的SRA-/-／CD36-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=7），炎症组（n=6），2组均喂以高脂饮食，炎症组小鼠采取皮下注射酪蛋白方法诱导产生慢性炎症模型，14周后应用实时荧光定量RT—PCR技术和免疫组化方法检测肝脏LDL受体基因及调控其转录的SREBP2、SCAP基因表达水平，并观察肝脏形态学及血生化指标的变化。结果与正常对照相比，炎症状态时肝脏LDL受体、SREBP2、SCAP mRNA水平显著高于对照组（P〈0．05），蛋白表达的水平也较对照组明显升高；肝细胞内脂质沉积加重，炎性细胞浸润；血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均明显降低（P〈0．05），高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯降低不明显。结论炎症通过促进肝细胞内SREBP2、SCAP的表达，进而增强细胞膜表面LDL受体的表达，最终导致肝细胞内胆固醇沉积。

去卵巢大鼠骨质疏松对下丘脑雌激素α受体的影响

目的 观察去卵巢雌性大鼠骨质疏松对下丘脑雌激素α受体(estrogen receptor alpha,ERa)及基基因表达的影响。方法 将45只SD大鼠随机分为对照组、假手术对照组和去卵巢组,用免疫组织化学方法和原位杂交方法检测下丘脑ERa及其mRNA表达。结果 去卵巢组ERa受体及其mRNA阳性细胞与对照组比较显著减少(P<0.01)。结论 下丘脑ERa受体及其mRNA阳性细胞的减少可能在绝经后骨质疏松发生起重要作用。

雌激素受体在大鼠血管平滑肌细胞中的表达及其调控

目的 :观察血管平滑肌细胞 (VSMC)中雌激素受体 (ER)的表达 ,研究雌激素和血清 (含多种生长因子 )对细胞中ER表达的影响。方法 :原位杂交和RT PCR检测大鼠主动脉中层VSMC中的ERmRNA。分别在有或无他莫昔芬 (TAM) (ER拮抗剂 )预处理的情况下 ,免疫细胞化学观察VSMC中的ER蛋白 ,比较雌二醇 (E2 )以及新生小牛血清 (NCS)对VSMC中ER表达的影响。结果 :VSMC中存在ERmRNA和蛋白 ,E2 以及NCS均能上调细胞中ER的表达 ,TAM能阻断其效应。结论 :ER是雌激素作用于VSMC的靶基因之一。

运动对载脂蛋白E基因敲除鼠oxldl及其内皮受体lox-1表达的影响

目的:观察氧化低密度脂蛋白(oxldl)及其受体血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(lox-1)在运动影响动脉粥样硬化形成中的变化。方法:对8周龄ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠饲以"西方饮食"饲料建立动脉粥样硬化模型,随机分为ApoE-/-安静组和ApoE-/-运动组。C57BL/6J小鼠为同源对照鼠,分为正常安静组和正常运动组。每组15只。运动小鼠进行12周中等强度跑台运动(10米/分×30分钟/天～13米/分×60分钟/天,每周5天)。采用ELISA及免疫组化方法检测血oxldl、lox-1的表达。结果:和正常安静组相比,ApoE-/-小鼠oxldl显著升高(P<0.01);ApoE-/-运动组oxldl较ApoE-/-安静组降低(P<0.05)。正常安静组和正常运动组血oxldl无显著性差异。正常安静组主动脉lox-1弱表达,ApoE-/-安静组病变内皮层、斑块中可见明显的棕黄色颗粒、棕黄色弧线,ApoE-/-运动组表达较ApoE-/-安静组明显减弱。经图像分析,正常安静组、正常运动组主动脉弓lox-1阳性表达面积和阳性面积百分比组间比较均无显著差异。和正常安静组相比,ApoE-/-安静组阳性表达面积显著增大(P<0.01)。ApoE-/-运动组阳性表达面积显著低于ApoE-/-安静组(P<0.01)。结论:12周有氧运动可下调ApoE-/-小鼠血oxldl水平,显著降低其受体lox-1表达。

诱导型巨噬细胞特异性敲除GRK2基因小鼠模型的构建及应用

目的 建立诱导型巨噬细胞特异性敲除G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因(GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+))小鼠模型。方法 基于Cre/LoxP系统构建GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳鉴定GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠的基因型。二氧化碳法处死小鼠后,Western blot检测骨髓源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞(PMs)中GRK2表达。免疫荧光检测小鼠脑、心脏和脾脏巨噬细胞中GRK2表达。流式细胞术分析前列腺素E2(PGE2)诱导的PMs中M1/M2比例。结果 基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在355 bp处有一条条带且Cre扩增产物长度在355 bp处有一条条带的小鼠即为GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。Western blot结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠BMDMs和PMs中GRK2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠脑、心脏和脾脏中GRK2表达降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例变化差异无统计学意义。在PGE2(10μmol/L)刺激下,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例升高(P<0.01),且GRK2^(flox/flox)小鼠PMs中CD86/CD206比例高于GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠(P<0.01)。结论 该研究成功构建出GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠模型,且该小鼠可促进PGE2诱导的PMs向M2型巨噬细胞极化。

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体基因敲除小鼠不同部位骨密度的动态改变

【目的】观察葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体基因敲除小鼠(GIPR-/-小鼠)不同部位骨密度的动态改变。【方法】用双能X线吸收仪(DEXA)测定不同月龄(1月龄、3月龄和5月龄)的雌性GIPR-/-小鼠和野生型对照C57BL/6小鼠不同部位(全身、股骨和腰椎)的骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)和骨骼面积。【结果】1月龄、3月龄和5月龄GIPR-/-小鼠的全身BMD、BMC和骨骼面积以及1月龄和3月龄GIPR-/-小鼠的股骨BMD均低于对照小鼠相应值,而1月龄GIPR-/-小鼠的腰椎BMD则高于对照小鼠相应值(P均<0.05)。5月龄与3月龄相比,GIPR-/-小鼠上述部位的BMD、BMC和骨骼面积无显著变化,而在对照小鼠仍有明显增加(P均<0.05)。【结论】与对照小鼠相比,GIPR-/-小鼠的BMD、BMC和骨骼面积均有明显改变,并与部位和月龄相关,提示GIP对小鼠骨转换有一定的作用。进一步提示在营养物的获得和骨代谢之间,除甲状旁腺激素-维生素D轴外,还存在着“肠-骨轴”,即肠道与营养代谢相关激素对骨代谢也有一定的调节作用。

应用ERKO小鼠研究雌激素受体在MPTP致帕金森病模型中的作用

目的:探讨雌激素受体(estrogen receptors,ERs)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中的作用特点。方法:应用经典化学毒素MPTP腹腔注射制备小鼠PD模型,WT、αERKO和βERKO雄性小鼠随机分为Saline组和MPTP组,爬竿试验观察行为学改变,荧光定量PCR法检测纹状体和中脑ERα、ERβ、TH、DAT和VMAT2 mRNA表达的变化。结果:与WT相比,αERKO小鼠中多巴胺缺失程度更大,爬竿试验显示αERKO小鼠更早出现行为学异常。αERKO和βERKO小鼠中脑TH、DAT和VMAT2 mRNA表达均降低。WT小鼠MPTP染毒致PD模型后,纹状体和中脑ERαmRNA表达增加,ERβmRNA表达降低。MPTP致PD模型后,αERKO和βERKO小鼠TH和DAT mRNA表达变化情况与WT小鼠不同,βERKO小鼠VMAT2 mRNA表达变化情况与WT小鼠相同,但αERKO小鼠VMAT2 mRNA表达变化情况与WT小鼠不同。结论:ERs在黑质纹状体DA系统中有神经保护作用,ERα亚型在此过程中发挥着更重要的作用。

肾脏D_5多巴胺受体高表达参与了血管紧张素Ⅱ1型受体基因敲除小鼠低血压的发生

目的肾脏血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的保钠潴水功能部分可以解释AT1R基因敲除(AT1A-/-)小鼠血压降低的原因,然而,对于是否有AT1R以外的机制参与则研究较少。既往的研究间接提示D5多巴胺受体和AT1R之间存在相互抑制作用,因而在本实验中,将验证D5受体的因素是否参与AT1A-/-小鼠低血压的发生。方法在比较AT1A-/-小鼠和其对照(AT1A+/+)小鼠血压、尿钠排泄、肾脏D5受体表达的基础上,利用Wistar-Kyoto(WKY)大鼠的肾近曲小管(RPT)细胞株和D5受体转染HEK293细胞为研究对象,研究AT1R和D5受体之间的交互影响,探讨AT1A-/-小鼠血压降低的原因。结果与AT1A+/+小鼠相比,低盐饮食的状况下AT1A-/-小鼠血压较低、尿钠排泄能力增强,肾脏D5受体表达量增加。在WKY大鼠肾近曲小管的细胞上,刺激AT1R可特异地抑制D5受体的表达;反过来,刺激D5受体转染HEK293细胞的D5受体也可抑制AT1R的表达。结论D5受体的高表达可能参与了AT1A-/-小鼠血压降低的发生机制。

利用基因敲除法探讨雌激素的心血管保护作用机制

基因敲除是通过同源重组方法定位突变细胞内某特定基因 ,使之失去功能。雌激素受体基因敲除小鼠的制备为研究雌激素的心血管作用机制提供了强有力的工具。雌激素由ERα介导促进内皮细胞依赖的血管舒张和内皮型一氧化氮合成酶表达 ,而对诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)的产生起抑制作用 ;相反 ,ERβ促进非内皮细胞依赖的血管舒张 ,促进iNOS产生。ERα介导雌激素对血管损伤和动脉粥样硬化的抑制作用 ,但ERβ的作用仍有争论。对ERβ基因敲除小鼠的表型研究发现 ,血管平滑肌细胞的离子通道发生变化 ,动物血压升高 。

瘦素受体基因敲除SD大鼠的表型及病理观察

目的观察CRISPR/Cas9技术建立的肥胖、代谢综合征和糖尿病前期特征的瘦素受体基因敲除大鼠模型的多种参数,为代谢性疾病的分子机制研究和新药研发提供更为理想的动物模型。方法1)定期测定Lepr^-/-大鼠的体重、摄食量、随机血糖和空腹血糖;葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验;血清血脂参数;2)观察14周和18周Lepr^-/-大鼠主要脏器的病理学改变;3)观察脏器脂质沉积情况。结果Lepr^-/-大鼠表现明显肥胖、高摄食量、葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗和血脂异常;14周和18周出现胰岛增生和心脏肌细胞肥大、脂肪肝、肥胖相关性肾病;肝细胞、肾小管上皮细胞和骨骼肌纤维内脂质沉积。结论Lepr^-/-大鼠是代谢性疾病的病因研究和新药研发的理想动物模型。